测定单糖组分

一株硅酸盐细菌胞外多糖的单糖组分分析


题目简介（200字以内）
硅酸盐细菌是最重要的土壤细菌之一，可以利用有限的营养大量生 产多糖。硅酸盐细菌的胞
外多糖具有很好的絮凝作用，絮凝特性要优于许多微生物，通常用于废水处理。 在不同培养
条件下，硅酸盐细菌的胞外多糖含量差异较大。据文献报道在培养基中加入矿粉，可以提高< br>硅酸盐细菌的胞外多糖含量，发酵液外观较对照组差异显著。本研究将通过苯酚- 硫酸法、
DART-MS技术来确定不同培养条件下多糖含量和单糖组分的差异。

任务简介
1、硅酸盐细菌的培养
2、胞外多糖的含量测定
3、胞外粗多糖的提取、纯化及酸水解
4、 LC- MS分析单糖组分差异
一、硅酸盐细菌的培养
种子液制备时，以接种环挑取单菌落2-3环于有氮液体培养基（蔗糖2.0 g，酵母
提取物 0.1g，硫酸铵0.04g，MgSO
4
·7H
2
O 0.2g，碳酸钙0.1g，K
2
HPO
4
·12H
2
O 0.2g，
pH 7-7.5）中，180rmin，30℃，摇床培养3天。发酵液培养基：配制添加 7种
不同矿粉的有氮培养基及不加矿粉的有氮培养基各200mL，接种量为10%（体
积比） ，150rpm 30℃培养5天。
有氮液体培养基：
蔗糖（C
12
H
22
O
11
）
酵母膏
10.0 g
0.3 g

(NH
4
)
2
SO
4
CaCO
3

MgSO
4
·7H
2
O
K
2
HPO
4
pH值
蒸馏水
0.2 g
0.5 g
1.0 g
1.0 g
7.0～7.5
1.0 L
115℃ 高压蒸汽灭菌20 min

胶质芽孢杆菌荚膜观察：用胶头滴管在 载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环从
培养液中挑取少量胶质芽孢杆菌，与水滴混匀，涂成薄层，然后 滴加10ul 10%
刚果红溶液染色2min，置于普通光学显微镜下观察细胞形态。
有氮固 体培养基培养，放大1000倍


二、测EPS含量
1、测蛋白质含量 ：用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。取1ml发酵原液，加入4倍体积-20℃
预冷的丙酮，4℃过夜。 离心，烘干，加2ml 40mM Trise在 80 ℃的水浴锅中加热溶解。
8000 r min 离心10min后取60ul上清于96孔板中加180ulBradford试剂，反应5min后于
595nm测定蛋白质含量。
测蛋白标曲：

图表标题
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08
y = 6.8667x + 0.0383
R? = 0.9884

蛋白质含量（mgmL）
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
无矿粉 凹凸棒石 滑石粉 硅灰石 磷灰石 钾长石 黑云母 蛇纹石


2、测多糖含量：用苯酚-硫酸法测定多糖含量。取1ml发酵原液(1ml单蒸水调零)，加3倍体积无水乙醇，4℃过夜。离心，烘干，加4ml水在 80 ℃的水浴锅中加热溶解。8000 r min
离心10min后取1ml 上清,加6%苯酚0.5ml，浓硫酸2.5ml，静置10min，摇匀，室温放置
20 min后，取200ul于96孔板中，于490nm测定吸光值。






测多糖标曲

多糖含量（mgmL）
7
6
5
4
3
2
1
0
无矿粉 凹凸棒石 滑石粉 硅灰石 磷灰石 钾长石 黑云母 蛇纹石

三、纯化多糖：
将培养 5 d 后的发酵液在8000 r min 离心20 min，取其上清液；将沉淀及少许液体合并后
再次离心取上清液；合并两次上清液在 80 ℃的水浴锅中浓缩 ，体积减少至原体积的三分
之一时 ，加入3倍体积的无水乙醇进行醇沉多糖 ，在4℃静止12 h以后，4000 r min
离心10 min ，收集沉淀，再分别用 95 %乙醇、无水乙醇，甲醇及乙醚洗涤沉淀，离心后得
多糖粗品，即粗多糖。将该多糖粗品用20 mL蒸 馏水溶解后，用savge试剂除蛋白5~7次后，
再次醇沉离心得到较纯多糖，即纯化多糖。