pET-28b(+)载体

pET-28b（+）载体
（基本信息、图谱和多克隆位点信息、简介、序列）

28a载体基本信息：
质粒类型：大肠杆菌表达载体
表达水平：高
克隆方法：多克隆位点，限制性内切酶
载体大小：5368bp
5' 测序引物及序列:
3' 测序引物序列:
载体标签:
T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His

载体抗性：
Kanamycin (卡那霉素)
N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处
病毒类型：非病毒
28a载体质粒图谱和多克隆位点信息：

28a载体简介
pET-28a-c(+)载体带有一个N端的HisThrombinT7 蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。pET28a载体的单一的
多克隆位点见上面的环 状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面 是
反向的。
T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的 F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，
包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生， 并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下终止蛋
白翻译。
28a载体简介

pET-2 8a-c(+)载体带有一个N端的HisThrombinT7蛋白标签，同时
N端含有凝血酶（Th rombin）蛋白酶
位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处

载体描述：
The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal His?Tag? thrombin T7?Tag?
configuration plus an optional C-terminal His?Tag sequence. Unique sites
are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the
pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular
map. The cloningexpression region of the coding strand transcribed by
T7 RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that
infection with helper phage will produce virions containing
single- stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore,
single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator
primer (Cat. No. 69337-3).

PET-28a-c(+) 向量进行 N-末端 His?Tag? 凝血酶 T7?Tag? 配置再加上可
选的 C-末端 His?Tag 序列。独特的网站显示在地图上圈。请注意，序列编号
pBR322 公约，所以 T7 表达区域反循环的地图上。克隆的表达区域的转录如下
所示的 T7 RNA polymeraseis 编码钢绞线。F1 起源是导向，以便辅助噬菌体感
染会产生包含对应于编码链的单链 DNA 病毒。因此，单个滞留测序应该使用进
行 T7 终结器底漆 （猫。69337 3 号）。



提取pet28质粒时，怎样才能得到高的浓度
Axugen的试剂盒已经很不错了,要是提不出浓度很高的质粒,可以试试下面的一些方法：
1、增加收菌次数,相对提高了质粒的量,这样的话裂解液的量可以适当增加；
2、裂解要充 分,变性和复性按说明应该是不超过5分钟,合理控制时间,一般在3分到4分半
的时间都是可以的；
3、过柱子时,吸附的时间尽量长一些,可以在这期间做做其他实验或者吃个饭什么的；
4、 如果没有必要,不使用去蛋白液,因为每过一遍柱子,其损耗越大,不过这得根据说明的菌种

而定；
4、最后洗脱回收的时候,要单方面提高浓度,就要适当减少洗脱液的量,我一般都是回收 到
40~50 μL的,同时要增加洗脱次数,一般两三次足矣.
如果以上方法都用遍了还无 效,就应该考虑菌种本身的问题,是不是冻融或者传代次数过高,
导致质粒本身丢失?质粒本身在大肠杆 菌的拷贝数是多少?不行的话建议重新将质粒导入到
大肠杆菌感受态细胞中.
一、
实验目的：扩增pET28质粒
先将质粒转化到大肠杆菌中，通过扩大培养获取大量含有质粒的大肠杆菌。
大肠杆菌的培养需要用到LB液体培养基。
根据质粒带有的抗生素抗性基因，还需要在LB中 加入适量相应抗生素，如氨苄青霉素、卡
那霉素等。
LB 液体培养基的配方(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5
g，NaCl 10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调 pH至7.5, 加去离子水至总体积 1 升,
高压下蒸气灭菌 20 分钟。
质粒提取目前一般都有商业化生成的试剂盒销售，可按照相应试剂盒的说明书操作。
转化：
① 取出感受态细胞（也有商品化感受态销售），冰浴10分钟。
② 取连接产物10μl 放入感受态细胞中（100μl管） ，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴 30
分 钟。
③ 42℃热休克 120 秒（按照需要加长或减少时间），不能摇动Ep管。冰浴 5 分钟，然
后转移到事先预热至 37℃的无抗生素的普通LB培养基800ul，50~100rpm 37℃恒温振荡 1
小时 30 分钟。
④ 用无菌弯头玻棒铺菌器将150ul 菌液铺于含有抗生素的 LA平板。 ⑤ 铺菌的LA 平板
于 37℃正放 2~3 小时，然后倒置培养 16-24 小时。
⑥ 将疑似阳性克隆的白斑选出，接到新的含有抗生素 的LB中培养14小时左右，做菌液PCR
或抽提质粒酶切以进一步鉴定转化是否成功。
转染：
① 将3μl（约4μg）纯化好的经除菌的质粒DNA溶入250μl 无血清培养基 DMEM (无
双抗) 中，轻轻混匀，室温放置 5 mim。
② 再吸取10 μl 脂质体溶入250 μl 无血清培养基 DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，
室温放置5 mim。
③ 将制备好的DNA 与脂质体轻轻混合均匀，室温放置20 mim。然后加入1.5 ml 无血清
培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，即为包裹好的脂质体DNA。
④ 将包裹好的脂质体DNA小心滴加至备用细胞表面，37℃，5% CO2，饱和湿度中孵育10
小时。
⑤ 弃去混合液，加入含10%胎牛血清的DMEM（无双抗），继续培养24-48小时
二．
（1）目的：从大肠杆菌中提取质粒DNA（碱裂解法）

（2）实验原理：
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此 选用适当浓度和适
当pH值的Tris-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积 到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 DNase的活性和 微生物生长。此

步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰
到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作
用， 加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在
这样的碱性条件 下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也
会断裂。
3、溶液III的作用 SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换
了SD S中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA
很长，容易 被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。
基因组DNA 一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与 PDS共沉淀。所以碱处理的时
间要短，而且不 得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步
操作混合均匀后在冰上放置， 可以使PDS沉淀更充分。
4、酚氯仿异戊醇的作用 PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀， 酚可以使蛋白质变性，
作用大于氯仿，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会 跑到上层，
不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚氯仿始终在下层，方便水相的回收。还有，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相
中，而酚 会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯
仿抽提一次将水相中的 酚去除。而用酚氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，
微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而 不必担心酶切等反应不能正常进行。异戊醇的添加，
主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方便水相 的回收。

（3）实验材料、仪器、试剂：
溶液Ⅰ
50mmoll 葡萄糖，25mmoll Tris·HCl（pH8.0），20mmoll EDTA （pH8.0）
溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；溶液III ：3 M 醋酸钾、 2 M 醋酸。

（4）操作步骤
１）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。
２）溶液Ｉ:
50mmolL葡萄糖 25mmolL Tris．Cl(pH8.0) 10mmolLEDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbfin2(6.895×104Pa) 高压下蒸气 灭菌15分钟，贮
存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触 震荡，
可使沉淀迅速分散。
２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ ：0.2molL NaOH（临用前用10molL贮存液现用现稀释） 1%SDS
盖紧管口， 快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接
触。不要振荡，将离心管 放置于冰上。
３）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ ：5molＬ乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3molL，对乙酸根是5molL。 盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上３－５分钟。
４）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。 ５）可做可不

做：加等量酚：氯仿， 振荡混匀， 用微量离心机于4 ℃以12000 g离心２分钟，将上清转
移到另一离心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未 知的原因，
省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
６）用２倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合， 于室温放置２分钟。 ７）用微
量离心机于4℃以12 000g离心５分钟。
８）小心吸去上清液，将离心管倒 置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液
滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的 吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用 吸头通过抽真空除去附于管壁
的液滴。
９）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀 ，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使
核酸沉淀干燥10分钟。
i. 此法制备的高拷贝数质粒（如Ｘf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3
－5μg。
ii．如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA

碱裂解法提取质粒。

质粒提取（碱裂解法）
（1）取1.5ml菌液于1.5mlEP管中，12000rpm x 1min，弃去上清液.（200ul枪头吸下）
（2）加入100ul溶液I，重悬（浑浊状） < br>（3）向（2）中加入200ul新制溶液II（现配现用，不得超过3min），轻轻翻转（此时变澄< br>清），4℃放置2min（打开后盖上有丝状物）。
（4）加入150ul预冷的溶液III， 加盖后温和颠倒数次（产生白色絮状物）。-20℃放置5min。
（5）10000rpm x 5min，取上清液于另一干净EP管中。
（6）（避免滴在手上）向上清液中加入等体积（约400 ul）酚氯仿异戊醇（25：24：1）
（取下层，在插入枪头后再按下，避免枪头中混有上层保护液， 吸出时迅速打入Ep管，防
止滴在外面。），振荡混匀（轻），12000rpm x 3min，将上清液转移至新的EP管中。（可
再次重复，抽取）
（7）向上清液中加入约800ul无水乙醇，混匀，-20℃放置20min。
（8）12000rpm x 5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
（9）加1ml 70%乙醇，吹打沉淀，12000rpm x 3min，倒上清液，扣滤纸上。吸去未倒完乙
醇，风干。
（10）（按总量）加入30-50ul，TE缓冲液、1ul RNAse，37℃，17min使DNA完全溶解。-20℃
保存备用。


①大肠杆菌质粒提取
②质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
③大肠杆菌感受态细胞的制备
④质粒DNA高频转化大肠杆菌
⑤线形质粒DNA 5'-粘性末端去磷酸
⑥PCR技术

双酶切

（1）分别取两支0.2mlEP管做上记号：如① ②
（2）两个EP管中分别配置下列的30 μL体系：
①
水
10xBuffer
NotⅠ
Bam HI
pET-28a

（3）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h。
琼脂糖凝聚电泳检测酶切结果
取5μL ① ② EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结
果。

胶回收
按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段。
胶回收试剂盒使用步骤：
1） 在紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带，注意刀片需消毒，胶块应尽量小，使之易
融化完全；
2） 事先将一个eppendorf管称重，然后将胶块放入后再次称重，获得胶块的重量； 3） 以
每100mg胶块加入300μl 的量加入Binding Buffer，查看胶块是否浸在液体中； 4） 56℃
水浴10min以融化胶块释放DNA，期间每2-3min 需取出震荡；
5） 待胶块完全融化后按照每100mg胶块150μl 的量加入异丙醇，充分震荡混匀； 6） 将
High Pure Filter Tube 安装到Collection Tube上；
7） 将所有eppendorf管中的液体转移到High Pure Filter Tube中去，注意不要超过700μl，
若超过需分两次离心；
8） 12000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的液体； 9） 加入500μl Wash Buffer后再次离
心1min； 10） 倒掉收集管中的液体后再次加200μl的Wash Buffer，12000 rpm 离心1 min；
11） 小心将Filter Tube取下后装入一个新的Effendorf管上； 12） 在滤芯的正中加上30
μl的Elution Buffer，室温放置1min，12000 rpm 离心1 min。


DNA的重组连接实验原理和步骤
一、实验目的
用T4dna连接酶将载体pBR322 EcoR Ⅰ-CIP处理的DNA片段，与目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片
段连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。

二、实验原理
重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的 连接缓冲液系统中，将
上述二种酶切后的DNA分子进行连接。
(一)DNA连接酶的作用步骤
1.T4DNA连接酶与辅助因子atp形成酶- AMP复合物(腺苷酰酶)
2.酶-AMP复合物再结合到具有5?-磷酸基和3?-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
3.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
3ul
3ul
2ul
2ul
20ul
水
10xBuffer
NotⅠ
Bam HI
pEGFP-N3
②
3ul
3ul
2ul
2ul
20ul

(二)DNA的连接方式 在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基
因的 处理以控制与调整DNA的有效连接。
连接的方式有：
1.自连
2.两种片段相连
3.三个片段以上的自连与互连
(三)连接反应的条件
1.缓冲液：一般商品酶都带有10倍的缓冲液，有Mg2+、ATP作为辅助因子，提供能量，同
时 也有些保护与稳定酶活性的物质，如DTT(二硫苏糖醇)以防止酶的活性基因氧化失活。
BSA(小牛 血清蛋白)维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低的酶变性失活。
2.温度：连接反应温度在37 ℃时有利于连接酶的活性，但是在这个温度下，粘性末端的氢键
结合是不稳定的，EcoR Ⅰ酶所产生 的末端，仅仅通过四个碱基对相结合，这不足以抵抗该
温度下的分子热运动。因此在实际操作时，DNA 分子粘性末端的连接反应，其温度是折中
采取催化反应与末端粘合的温度，为12～16℃。
3.时间：12～16℃ 12～16小时(过夜);或7～8℃ 2～3天。

三.实验材料
322 EcoR Ⅰ-CIP处理DNA片段。
2.5.4Kb含有Str的EcoR Ⅰ回收DNA片段。
3.T4DNA连接酶

四.实验仪器、器皿及试剂
仪器、器皿(见附录)
试剂：10×T4DNA连接酶缓冲液
660mmolL Tris-HCl(pH7.5)
50 mmolL MgCl2
50 mmolL DDT
50 mmolL ATP

五.实验步骤
1.取3只Eppendorf管，一管做重组连接，一管 做pBR322未经CIP处理的自连，另一管做
pBR322经CIP处理的自连。
2.用微量进样器按下表分别取样各溶液于Eppendorf管中。
DNA酶切反应物
10×T4连接缓冲液
ddH2O
T4DNA连接酶
总体积
pBR322 EcoRⅠ-CIP
5μl(100ng)
5.4Kb EcoR Ⅰ片段
5μl(约400ng)
2μl

7μl
1μl
20μl
pBR322 EcoRⅠ-CIP
3μl(60ng)
2μl
14μl
1μl
20μl
pBR322 EcoRⅠ
3μl(60ng)
2μl
14μl
1μl
20μl 加样顺序为ddH2O，10×T4缓冲液，DNA片段，最后加T4DNA连接酶(放于冰浴中)连接酶< br>取好后应立即放回-20℃保存。
3.盖紧盖子用手指弹匀Eppendorf管，于台式离心机上转2秒钟，以集中样品。
4.将3管连接样品放入温度12℃恒温水浴锅中，过夜。
5.第二天上午各管取约25ng 的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳
时要加入pBR322 EcoR Ⅰ酶切片段作电泳对照。

重组质粒的连接、转化及筛选
一、 材料
外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒
(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的
菌株。
二、 设备
恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，
电泳仪无菌，工作台， 微量移液枪，eppendorf管。
三、 试剂
1、连接反应缓冲液(10×)：0.5molL Tris·Cl (pH7.6)，100molL MgCl2，100molL 二硫
苏糖醇 (DTT)(过滤灭菌），500μgml 牛血清清蛋白(组分 产品）（可用可不用），
10molL ATP（过滤灭菌）。
2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
3、X-gal储液(20mgml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mgml的储液, 包以铝箔
或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
4、IPTG储液(200mgml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至 1ml,
用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮
沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50mgml，然后摇
匀后涂板。
6、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50μgml Amp的LB平板表面加
40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置 于37℃下放置3-4小时,使培养基

表面的液体完全被吸收。
7、感受态细胞制备试剂: 见第三章。
8、煮沸法快速分离质粒试剂: 见第一章。
9、质粒酶及电泳试剂: 见第二章。

第三节 操作步骤
一、 连接反应
1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。
2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。
3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷
却至0℃。
4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体
全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。
同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA
片段没有质粒载体。
二、 E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化
每组连接反应混和物各取2μl转化E. coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。
三、 重组质粒的筛选
1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养 基上,37℃下培养半
小时以上,直至液体被完全吸收。
2、倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平
板。
3、放于4℃数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做）。
不带有pBS质粒 DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。
带有pBS载体的转化子由 于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌
落。在X- gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β- 半乳糖苷酶
活性,在麦康凯选择性培养基和x -gal和ITPG培养基上均为白色菌落。
四、 酶切鉴定重组质粒
用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μgml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振
荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒D NA直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS质粒做
对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢 。再用与连接未端相对应的限制性内切
酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。
[注意] 1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一
般使用连 接粘性末端酶量的10-100倍。
2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般 为2-10mgml，在连接平齐末端
时，需加入DNA浓度至100-200mgml。
3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会
降低转化 效率。
4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温 度
为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。
5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5< br>倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。
6、麦康凯 选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡
红色菌落，而携有带插入片 段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，

且价格低廉。但需及时 挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响
挑选。
7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D- 半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- galactoside)以< br>半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代 半乳糖苷
（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导 lacZ的表达。
8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝 色菌落，而携带
插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使 显色
反应充分，蓝色菌落明显。


参考文献：
百度文库：《从大肠杆菌中提取质粒DNA》
《大肠杆菌质粒提取》
《大肠杆菌质粒DNA的提取》
《碱性裂解法提取质粒》
《质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序 》
《胶回收试剂盒使用步骤》
生物帮资讯：DNA的重组连接实验原理和详细步骤
丁香园论坛：重组质粒的连接、转化及筛选