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实验二
血涂片的制备
Preparation of Blood Smear
实验原理
使用推片将血液在载玻片制成血膜。
试剂器材
载玻片（清洁、干燥、无尘
、无油脂、
25cm
×
75cm
，厚度
0.8mm~1.2mm
）
、
推片。
操作步骤
（
1
）采血
静脉采血后，使用玻璃棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一
端
1cm
处
加
1
滴
（约
0
.05ml
）
抗凝血，
如果使用手指采
血则直接用洁净玻片蘸
1
滴血。
（
2
）
推片
<
/p>
左手平执载玻片，
或放在类似桌子等平
坦
地方，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿
推片边缘展开成适当的宽度，立即将
推片与载玻片呈
30
。
~45
。
角，
轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血
涂片（图
1-6
）
，
血涂片应呈舌状，
头、体、尾清晰可见。
（
3
）
干燥
将推好的血涂片在空气中晃动，
使其
迅
速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于
37
℃温箱中保温促
干，以免细胞变
形缩小。
图
1-6
推片
（
4
）标记
在载玻片的一端用记号笔编号。
注意事项
1
．要制备良好的血细胞涂片，玻片必须干净。新购置的载玻片常带有游离
碱质，必须用约
1mol/L HCl
浸泡
24h
后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。用
过的载玻片可放入含适量肥
皂或其他洗涤剂的清水中煮沸
20min
，洗净，再用清
水反复冲洗，
蒸馏水最后浸洗后擦干备用。
边
缘破碎、
玻面有划痕的玻片不能再
用。使用玻片时，只能手持玻
片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干
燥、中性、无油腻。
< br>
2
．
最好使用非抗凝血制备血
涂片，
也可用
EDTA
抗凝血制备。<
/p>
使用抗凝血标
本时，应充分混匀后再涂片。抗凝血标本应在采集后
4h
内制备血涂片，时间过
长可引起中
性粒细胞和单核细胞的形态学改变。
制片前标本不宜冷藏。
涂片
的厚
度、
长度与血滴的大小、
推片与载
玻片之间的角度、
推片时的速度及红细胞比容
有关。一般认为血
滴大、血粘度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜
薄。
故针对不同病人应有的放矢，
对血细胞比容高、
血粘度高的病
人应采用小血
滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。
3
．血膜应厚薄均匀适度，头尾及两侧有一定
的空隙。如血膜面积太小，可
观察的部分会受到局限，
故应以在
离开载玻片另一端
2cm
的地方结束
涂抹为宜。
一些体积特大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，
因此
画线应注意保存血涂片尾部
细胞。
4
．血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地
吸附在玻片
上，在染色过程中容易脱落。
实验评价
血涂片制备是血液学检查的
重要基本技术之一。
一张良好的血片，
厚薄要适
宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。
血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。除可
获得满意的血涂片外，
抗凝的血液病标本离心后取其灰白层涂片，
可提高阳性检
出率。此外，还可根据不同需要（如疟原虫、微丝蚴检查等）
采用厚血涂片法。
随着当今的自动化的发展，
出现了自动血液涂
片和染色装置。
自动的血液涂抹装
置主要有两类，
一类是离心法，
可以将少量细胞浓缩涂片；
另一类是
机械涂片法，
其模拟手工涂片，
适用于大量血涂片的制备。
一般来说自动血液涂片装置可获得
细胞分布均匀、形态完好的血片，
但尚未普遍推广。
思考题
从外观来判断，一张好的血涂片有哪些特征？
血涂片的制备与染色
血涂片的制备
:
【器材】
清洁、干燥、无尘、无油脂
的载玻片
(25
㎜
×
< br>75
㎜
,
厚度为
0.8
～
1.2
㎜
) .
【操作】
血涂
片制备方法很多
,
目前临床实验室采用的是手工推片法
,
在玻片近一端
1cm
处
.
加一滴
0.05ml
充分混匀的
血液
,
握住另一
张边缘光滑的推片
,
以
30°
～
45°
角使血滴沿推片迅速散开
,
快速、平稳地推动推片至载玻片的
另一端
.
【附注】
1.
血片通常分头、体、尾三部分
.
2.
推好的血涂片应在空气中晃动
,<
/p>
使其尽快干燥
.
天气寒冷或潮湿时
,
应于
37
℃恒温箱
保温促干
,
以免细胞变形
缩小
.
3.
涂片的厚薄、长度与血滴的大小、推片
与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞的比容有关
.
一般
认
为血滴大、角度大、速度快则血膜厚；反之则血膜薄
.
4.
涂片应在
1h
内染色或在
1h
内用无水甲醇固定后染色
.
5.
新购置的载玻片常带有游离碱质
,
必须用浓
度约
1mol∕LHCL
浸泡
24h<
/p>
后
,
再用清水彻底冲洗
< br>.
血涂片染色
:
瑞士染色法
【原理】
瑞士染色法使细胞既有化学亲和反应
,
有又物理吸附作用
.
各种细胞由于其化学成分不同
,
对酸性及碱性染料
的结合力也不同
,
因此
,
染色后各种细胞呈现出各自的染色特点
.
【试剂】
瑞士染液
Ⅰ液
:
瑞士染料
0.1g ,
甲醇
60.0ml
瑞士燃料有酸性燃料伊红和碱性染料美蓝的氧化物
(
天青
)
组成
.
将瑞士染料放入清洁干燥研钵里
,
先加少量
的甲醇
,
充分研磨使燃染料溶解
,
将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中
,
未
溶解的在加少量甲醇研磨
,
直至染料完
全溶解
,
甲醇全部用完为止
.
配好后放入室温下
,
一周后即可使用
.
新配染液效果较差
,
放
置时间延长
,
染色效果
越好
.
久置应密封
,
以免甲醇
挥发或氧化成甲酸
.
染液中也可加中性甘油
2
～
3ml,
除可防止甲醇过早挥
发外
,
也
可使细胞着色清晰
.
Ⅱ液
:
Ph 6
.4
～
6.8
磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾
(KH2PO4)
0.3g
磷酸氢二钠
(Na2HPO4)
0.2g
加蒸馏水加至
1000ml.
配好后
用磷酸盐溶液校正
PH,
塞进瓶口贮存
.
如无缓冲液可用蒸馏水代替
.
【附注】
对细胞染色有影响
.
2.
未干透的血膜不能染色
.
否则染色时血膜易脱落
.
3.
染色时
间与染色浓度、染色时温度成反比
;
而与细胞数量成正比
.
4.
冲洗不能先倒掉染液
,
应用流水冲去
,
以防染料沉
淀在血膜上
.
5.
如血膜上有染料颗
粒沉积
,
可加少许甲醇溶解
.
【操作】
1.
采血后推制厚薄适宜的血涂片
.
2.
用蜡笔在血膜两边
划线
,
然后将血膜放在染色架上
.
3.
瑞士染液数滴
,
以覆盖整个血膜为宜
,
< br>定血膜约
1min.
< br>4.
滴加约等量的缓冲液与染液混合
,
< br>室温下染色
5
～
10min.
5.
用流水冲去染液待干燥后镜检
.
步骤
：<
/p>
采血
，
推片
，<
/p>
干燥
，
标记，染色
1.
采血准备工作
：
按摩
，
消毒，针刺
，
吸血，止血
2.
推片
:
一张良好血涂片的要求
：
厚薄适宜
，
头体尾明显
，
细
胞分布均匀
，
边缘整齐
，
两端和两边留有空隙
血涂片制备的注意事项：血滴
愈大，角度愈大，推片速度愈快，则血膜愈厚；反之，血涂片愈薄。针对不
同患者应有的
放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者宜采用小血滴、小角度、慢推；贫血患者则相反。
引起血涂片分布不均的主要原因：推片边缘不整齐（毛刷状）用力不均匀（阶梯状）
载片
不清洁（有空泡）
3.
干燥
：
将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速
干燥。天气寒冷或潮湿时，应于
37
℃温箱中保温促干，
以免细胞变形缩小
4.
标记
5.
染色：
瑞氏染色法
(Wr
ight’s stain)
1.
染液成分：
①
美蓝（亚甲蓝）：
M
＋碱性染料
②
伊红（曙红）：
< br>E
－酸性染料
③
瑞氏染料：
M
＋＋
E-
ME
↓
（伊－美中性物）
④甲醇：溶解染料；固定细胞形态；蛋白质呈颗粒或网状，增加细胞与染料的接触
< br>
2.
染色原理：
①
基本原理：物理吸附、化学亲和作用
②
碱性物质（
Hb
、嗜酸性颗粒）
――
嗜酸性物质
、染成粉红色（
E
－）
③
酸性物质（核蛋白、
RNA
）
――
嗜碱性物质、
染成蓝
或紫蓝色（
M
＋）
④
< br>中性颗粒（中性细胞胞浆）――嗜中性物质、染成淡紫红色（
M
< br>＋
E
－）
pH
的影响：
H
＋（
PBS <
br>: 血液对于每个学生来说既熟悉又陌生。说学生熟悉血液，是因为每个学生几乎都有流 血液分层演示装置
pH
）：蛋白质与碱性染料（
M+
）亲和力下降，增强伊红着色，出现红染
OH
－（
pH>PI
）：蛋
白质与酸性染料（
E-
）亲和力下降，增强美蓝着色，出现
蓝染
PBS
缓冲液：
pH :
6.4
－
6.8
以维持恒定的
pH
环境
3.
染色方法
①固定：滴加染液
3 ~
5
滴，覆盖整个血膜固定细胞
0.5
－
1
min
②染色：加
1 ~
2
倍
PBS
缓冲液，混匀染
5 ~ 10min
③冲洗：平衡摇动，于自来水龙头上平置冲洗（从一端开始），或加
缓冲液冲洗
4.
染色结果
①外观：淡紫红色
②
镜下：红细胞――粉红色碟状白细
胞――胞核、胞浆及颗粒显示特有的染色特征
5.
红细胞与中性粒细胞
注意事项：
红细胞
淡红色圆盘状，中央有生理性淡染区。中性粒细胞：细胞核染深紫红色，细胞质
呈粉红色，含有许
多细小的淡粉红色颗粒，淋巴细胞：细胞核染深紫红色，胞质少，仅在
核的一侧见到少量淡蓝色胞质
①
血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落；
②
染色时间与染液浓度、室温及有核
细胞多少有关，一般染液淡、室温低，有核细胞多，染色时间长。
③
染液不能过少，以防蒸发沉淀；
④
冲洗时不能先倒掉染液，应以细流水从一边开
始冲，防染料沉着，冲洗时间也不能长；
⑤
染色过淡时可复染，复染时先将染料稀释好；
⑥
染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色；
⑦
分类最佳区域为体、尾交界处。
第一节
流动的组织──血液
──血液
一、教学目标
1.
描述血液的成分和主要功能。
<
/p>
2.
使用显微镜观察人血的永久涂片，尝试识别红细胞和白细胞。
二、教学策略
血、抽血和验血的经历，对血液的颜色等有一些感性的认识，还可以从报刊、杂志、电视和
广播中获取到有关血液的信息。
说学生对血液陌生，
是因为学
生大都不知道血液里到底含有
哪些成分，以及每种成分各有什么功能。总之，学生对血液
感到很新鲜，甚至有一些恐惧。
因此，
教师可以先让学生自由发
言，
交流各自对血液的认识，
以激发学生的学习兴趣。
然后，
教师可以出示一张医院的血液化验单，
让
学生回忆和讨论血液化验的主要内容。
教师可以将
学生的回答记
录在黑板上，为后面的教学做铺垫。
当然，
学生的回答往往不很
全面，不很系
统。这时，教师不要忙着补充，而是要及时评价学生从生活经验和课本外获
取信息的能力，
鼓励学生继续积极补充，
再进行归纳，
为下一步的教学打好基础。
教师可以将课前准备好的
(
可以用鸡、鸭或家鸽的血，
也可以用猪、牛或羊的血
)
演示给学生看，
并
让学生讨论资料分析中的
3
个问题。
关于血浆，教师只需作简要的介绍。需要指
出的是，水占了整个血浆的绝大部分，这
可以为后面介绍无偿献血做铺垫。
关于血细胞，
教材的意图是让学生先通过显微镜观察人血
的永久涂片，
从感性上认识红细胞、
白细胞的形态以及数量
多少，
然后从理性的角度进行学
习，
这
样做可以激发学生自主学习、
积极开动脑筋和主动求知的学习热情。
在这一部分内容
的教学中，
教师介绍红细胞、
白细胞和血小板的主要功能时，
应该特别注意与生活实际中的
一些问题相联系，
如贫血、
化脓和伤口处血液逐渐凝固
等，
这有助于调动学生的学习积极性，
并加深学生对基础知识的
理解和记忆。
三、参考答案
资料分析
1.
血液中含有不同的组成物，它们的质量不一样，所以，含有抗凝剂的血液离心或静
置一
段时间后，就会逐渐分成上下两层以及中间一薄层白色物质。
2.
血液是由上层的淡黄色半透明液体，下层深红色部分以及中间的很薄的一层白色物<
/p>
质组成的。
红细胞和所含的血红蛋白在下层深红色的物质里，
白细胞和血小板在中间很薄的
一层白色物质中。
3.
血液中有大量的血细胞，这些细胞与血浆共同构成血
液，完成物质运输等功能，因
此，血液是一种组织，属于结缔组织。血液可以流动，因此
称做“流动的组织”。
实验
1.
数量最多的是红细胞。
2.
红细胞呈两面凹的圆饼状，红色，数量多，不用染色就可以观察到；
白细胞的个体
比红细胞大，数量少，只有经过染色才能观察清楚。
3.
血小板比红细胞和白细胞小许多，并且需要进行特殊的
染色，所以在光学显微镜下
看不到血小板。
练习
1.
大
量出汗时，血液主要丢失水分和一部分无机盐。通常采用喝水和适量补充无机盐
的方法，
来补充血液中丢失的这些成分。
严重腹泻时，人体主要丢失水分、
一部分无机盐和
葡萄糖等营养物质。
通常采用喝水、
适量补充无机盐以及静脉滴注
(
或口服
)
葡萄糖溶液等方
法来补充血液中丢失的这些成
分。
2.
贫血患者的症状是：面色苍
白并有头昏、乏力、心悸、气急等症状。血红蛋白是一
种含铁的蛋白质，一般地说，贫血
患者应当多吃一些含铁的食物和蛋白质丰富的食物。
3.
昆明属于高原地区，同平原地区相比，空气中氧的含量比较少。在这种环境下集训，
可以增加足球运动员血液中血红蛋白的含量，从而增强足球运动员血液的供氧能力。
4.
白细胞吞噬了病菌和死亡的细胞后，自己也会
死亡，所以白细胞的寿命比较短。
四、背景资料
人血常规化验单说明表
下表是我国有
关
RBC
、
WBC
、
Hb
和
PLT
< br>的正常参考值和说明。
检查项目
正常参考值
英文缩写
中文名称
说明
RBC
红细胞
计
数
男：<
/p>
(4.0
～5.5)×10
个
/L
女：
(3.5
～5
.0)×10
个
/L
12
12
人体在运动、饱食和缺氧等情况下，红细胞
数会
时增加。贫血时，红细胞数会明显减少。
人体在失血、剧痛、烧伤、炎症、白血病等，以
WBC
白细胞
计
数
(4<
/p>
～10)×10
个
/L
9
女子月经、妊娠和分娩期时，白细
胞数会明显增
在药物中毒、骨髓造血机能损害等时，白细胞数
明
显减少。
Hb
血红蛋白
男：
120
～
160 g/L
女：
110
～
150 g/L
贫血时，血红蛋白含量会明显减少。
PLT
血小板
计
数
(100
～300)×10
个
/L
9
血小板数过少，
机体会异常出血。血小板数过多
机体易形成血栓等。
实验用血的采取
< br>取血时必须注意两点：一是要取新鲜的血液；二是应该在取出的新鲜血液中立即加入
一定量的抗凝剂，以免血液凝固。具体做法是：
取一个试管
，滴入几滴抗凝剂，如质量分数为
5%
的柠檬酸钠溶液，再注入
3
～
5
mL
(
多
注入数毫升，效果更明显
)
哺乳动物的血，轻轻震荡试管，使血与抗凝剂混合均匀。
下面简单地介绍一下用心脏穿刺法从活家兔体内取血的方法。
一个人用左手握住家兔的耳朵和前肢，用右手握住家兔的尾巴和后肢，将兔仰放在实
验台上。另一个人用手摸出家兔心脏跳动最强的部位，剪去该处的兔毛，用酒精消毒，
然后
用消毒过的注射器
(
取血之前，
要在注射器针管内注入一点儿抗凝剂，
以免取出
的兔血凝固
)
，
刺入家兔的心脏抽取血
液
(
约几毫升
)
。
取血之后，
家兔还可能正常活下去。
取得的血待静置
几小时以后，
血细胞全部沉降下去，
血浆浮在上面，
血液就明显地分成血浆和血细胞两部分。
红细胞、白细胞和血小板在人体内的种类、形态、大小、数目和作用
红细胞
成熟的红细胞没有细胞核，呈两面凹的圆饼状，平均直径只有
7.7 μ
m，成
年人每立方毫米血液里红细胞的数量，
男子平均为
4.0
～5.5×10
个／
< br>L
，
女子平均为
3.5
～
5.0×10
个／
L
。红细胞具有运输氧的功能，此外，红细胞还能运输一部分二氧化碳。
< br>
12
12
白细胞
白细胞有多种，都有细胞核，比红细胞大，但数
量少，每升血液里只有
4
～
10×10
个。有些白细胞可以吞噬病菌，对人体起着防御和保护的作用。
人们根据白细胞里是否含有特殊染色颗粒，将白细胞分为粒细胞和无粒细胞两大类。
粒细胞又可以根据所含的特殊颗粒染色性质的不同而分为嗜中性粒细胞、
嗜酸性粒细胞和嗜
碱性粒细胞。
无粒细胞包括单核细胞和淋
巴细胞。
人体处在正常情况时，
外周血液内各种白
细胞的数量有一定的比例。
人体发生炎症或其他疾病时，
血液内白细胞的总数或白细胞分类
百分比就会发生变化，所以白细胞的分类计数，常
被用作诊断疾病的检查方法之一。
现将正常人白细胞的分类计
数和各种白细胞的主要功能列表
(
表
6
)
如下：
表
6
正常人白细胞分类计数范围和各种白细胞的主要功能
9
名
称
百分比
主要功能
以变形运动方式，穿出小静
脉壁，进入感染
发炎的结缔组织中，吞噬和消化侵入人体的
各种
病菌，
清除损伤和死亡的各种组织细胞。
所以，急性感染时增多
。
与过敏反应有关，在过敏或有寄生虫病时增
多。
此外，
它还与抗原抗体复合物有亲和力，
并能吞噬抗原抗体复合物，消除复合物对组
织的有害作用。
能产生和贮存组织胺和肝素。与人体的过敏
反应有
关。
有变形运动的能力，在人体免疫过程中起重
要作用。
也有活跃的变形运动和吞噬活动，还能协
助
淋巴细胞在免疫中发挥作用。
粒
细
胞
嗜中性粒
细胞
50
～
70
嗜酸性粒
细胞
3
～
5
0
～
1
嗜碱性粒
细胞
无
粒
细
胞
淋巴细胞
25
～
40
单核细胞
2
～
8
血小板
血
小板比红细胞和白细胞都小得多，形状不规则，没有细胞核。每升血液中
的含量为
100
～300×10
个，血小板有止血和加
速凝血的作用。
血红蛋白特性的观察
(
演示
)
取
一试管加有抗凝剂的血液，待血细胞沉淀后，倒去上层的血浆和部分血细胞，观察
留在试
管内的红细胞呈暗红色。然后将试管倾斜放置，
10
分钟以后，
斜面的红细胞呈鲜红
色，
试管底部的红细胞仍为暗红色。
说明血红蛋白与氧结合或分离的条件与周围环境中氧气
3