RACE实战经验(节省新手时间)一、我刚做过5、3RACE,我个人的

RACE

实战经验（节省新手时间）

一、

我

刚做 过

5

'

、

3

‘

RACE

我个人的经验如下：

1

、

首先， 提的

RNA

必须完整，最好跑个

RNA

电泳来验证一下；

2

、

设计引 物时要注意：

Tm

最好大于

70

度，两引物间要有

100-200bp

的重 叠区；

Tm

最好大于

70

度的原因如下：

a

）

T

m

大于

70

度，好做

touchdown PCR

；

b

）

相

应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较

难

扩的产物。

插曲：为什么要做

Touchdown PCR?

touchdown PCR

是退火温度一步一步降低

，

指第一阶段

PCR

时 退

火温度在每一个循环都降低一定的值如此扩几个循环

，

然后进入

正常

PCR

。这样开始的是特异性高的目的片断，到后来目的片 断

增

加后，降低退火温度来提高产量 。非特异带再开始高温扩增少，

后面

温度降低时，特异带产量已高于非特异产物，最后特异产物

再最终产

物中占优势。

3

、

用巢氏

PCR

相对容易出结果；

4

、

如果出现多个条带，要分别验证；

5

、

PCR

过程中，我一般分两次，第一次用

touchdowm PCR

，后产

物

稀释

50

倍 ，作二次，

72

度尽量长一点，我们一般用

2-3min

；

6

、

结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。

二、

花

了

2

,

3

个月，我的

5

‘

RACE

试验总算成功了，有些心 得体会

与大家分享。

我用的是

Gen eRacer Kit

，约

5000

人民币

/kit

，可做

5

次。本人

用

过

GenRacer, Oligo-capping

等全长

cDNA

合成方法。除了作

过不同的方法之比较外，也有诸多 实战经验。希望同仁们能对下面两

篇

敝作予以指正。特别提醒，在用

Gen Racer

时，还碰到过一

bug,

多次对

产物测序结果竟然显 示引物内的序列与说明书中不一致，

海博亚公司重新合成引物后，作对比实验，发现试剂盒中引物

的真实存在。各位可要小心。

最初我严格按照说明上的要求，总

RNA

取其要求的最大量即

在上

bug

5ug

（非常少，沉淀后几乎看不到），再进行

RNA

脱磷酸反应，反应

后

用苯酚：录仿等沉淀

rna

;

再进行

mRNA

脱 帽反应，反应后用苯

酚：录

仿等沉淀

rna

;

再用

T4 RNA ligase

连接脱帽

mRNA

至

Gen eRacer

RNA OLIGO

上，反应后再次用苯酚：录仿等沉淀

rna

；

最后用

superscript III

进行

RT

反应，最后用

Gen eRacer 5

'

primier

及我的下

游

GSP

用高保真酶进行

< br>PCR

。

但由于说明上要求的总

RNA

实在太少，每次酶促反应后均要重

新

抽提沉淀

rna

（已去除酶等），几次一来后就看不到

RNA

沉淀了，

RT-

PCR

结果为阴性。后来我考虑到酶的特点之一就是 其有高效性，

于是就

不顾说明书上的要求，取总

RNA

的量远大与其要求（至少

10ug

），结果就出来了！！

！

经验：

1

。总

RNA

质量要高，先电泳看

28s18s,28s

亮度应该是