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胶体金免疫分析技术
随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，
免疫
分析正在向两个方向发展：
一类为全自动化的免疫分析；
< br>另一类为以硝酸纤维膜
为载体的快速免疫分析。
前者需要
价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各
种试剂盒，
目前只
能在医疗及检测中心应用，
虽也能较快速给出结果，
但仍需一<
/p>
定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于
“
患者床旁检验
”
和普查
的需要，
在酶免疫分析的基础上，
主要以硝酸纤维素膜为载体
的快速诊断方法迅
速和广泛地发展起来。
这类方法目前在文献及
市场上的命名还很不统一。
它实际
上属于快速斑点免疫结合分析
，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析
DIFA
和斑点免疫
层析分析
DICA
。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫
分析技
术。
金标记免疫分析技术也称
免疫胶体金技术，
是于
1971
年建立
的一种信号显示技术。
此技术最初用于免疫电镜检查，
由胶体金
颗粒标记抗原或抗体，
与组织或细胞中相应的
抗体或抗原相结合
，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染
技术相结合建立的免
疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。
近
10
多年来，利用硝酸纤维素膜（
NC
）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与
特异配体的反应在膜上进行，建立了
快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技
术，并在传染病、心血管病、风湿病、自
身免疫病的免疫学检测中广泛应用。
胶体金是指金微小粒子（
0-100nm
）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金
以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，
用此金溶胶标记蛋白
质
（抗原、
抗体或
SPA
、
SPG
）
，
胶体金颗粒具有高电子密度的特性，
故在金标蛋白的抗原抗体结合处，
显微镜下
可见黑褐色颗粒；
当这些标记物在相
应的标记处大量聚集时，
可在载体膜上呈现红色或
粉红色斑点，
从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。
与
ELISA
不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了
ELISA
需数小时才能显示的结果。因为在
GI
FA
和
GICA
中，高浓度的抗体集中
固定在
纤维素的微孔中，
待测抗原在渗滤或层析时，
流经微孔与固定的高浓度抗体紧密
接触，
很快完成
免疫结合反应。
这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中
的免疫浓缩作用。在
ELISA
中，待测抗原要在液相中经过扩
散作用，逐渐与吸
附在固相表面的抗体结合。
同时，
标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体
-
抗
原
-
标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实
的
POCT
。
原理：
将氯金酸（
< br>HAuCl4
）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金）
< br>，标记
金黄色葡萄球菌
A
蛋白（
SPA
）或抗体，用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快
速免疫渗滤、
免疫层析实验。
金标记免疫渗滤
技术的原理同一般的免疫斑点试验，
也是用已知抗原或抗体包被
NC
膜，
再用金标记抗体或抗原来进行快速快速测定，
阳性时斑点呈胶体金的红色。
改进之处为采用了渗滤装置，
更加简便。
金标记免
疫层析则是利用
NC
膜条状纤维的毛细管作用，使样品在涌动中与金标记物及包
被在
NC
膜上的抗原或抗体结合，出现呈色的阳性信号
。
胶体金的制备：
在溶液中金颗粒呈圆
形，
边缘平整，
界线十分清楚。
金颗粒
表面带有大量负电荷，
由于
静电的排斥力，
使其在水中保持稳定状态，
形成稳定的胶体，
所以称其为胶
体金。
胶体金的
制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬
酸三钠还原法和鞣酸
—
柠檬酸三钠还原法。
通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例
（即增加或减少还原剂的量）
可得到所需不同直
径的金颗粒。
但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，
所以目前常用后两种方法，<
/p>
以
柠檬酸三钠还原法为例。
Frens
标准方法：
（
1
）取
0
、
01%HAuCl4
溶液
5
0mL,
加热煮沸，随即快速加入
1%
柠檬酸三钠溶
液
0.5mL.
（
2
）
约过
25s<
/p>
沸腾的溶液变为淡蓝色，
大约再过
70s
，
蓝色突然转变为亮红色，
（
3
）继续煮沸约
5<
/p>
分钟后结束反应。
（
< br>4
）冷却后用
0.1M K2CO3
溶液调至所需
PH
值。
（
5
）此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬
酸三钠都不影响实验结果。
该法制备得到的金颗粒直径约为<
/p>
41nm
，如前所述，要想得到更大或更小的
金颗粒，
该方法依然可行，
唯一不同的是需要改变加入还原
剂的量。
另外，
采用
此标准方法所需反
应时间最短。
附注：有研究者已经注意到影响胶体金质量及其
稳定性的几种因素，制备过
程中器具若全部使用干净的玻璃器皿，溶液一律用
0.2?
m
滤膜过滤后使用，水
< br>用玻璃三蒸水，
推荐使用超纯水，
采取这些措施后制得的
胶体金很稳定。
这些措
施表明即使很微量的污物都会对胶体金制
备带来不良影响。
虽然经常可见推荐使
用硅化玻璃器皿的说法，
其实使用普通玻璃器皿同样也能制出高质量高稳定性的
胶体金。
免疫金的制备
胶体金与抗原（或抗体）的结合物称为免疫金或胶体金标记物，
在免疫组织化学技<
/p>
术中，又习惯称之为金探针。
胶体金标
记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与
蛋白质所带正电荷基团
之间产生静电吸引而牢固结合，
这种结合对所标记蛋白的
生物学
活性无明显影响。环境
pH
和离子强度是影响胶体金与抗原（抗
体）吸附
的主要因素，
胶体金颗粒的大小、
蛋白质的分子量及浓度等也影响蛋白质的吸附。
一般制备
方法为：
1
、胶体金
pH
的调整（用
K2CO3
或
H
CL
溶液调节
pH
至选定值。
原则上可选择待标记蛋白质等电点，
也可以略偏碱。
但各标记物的最
适反应
pH
往往需
多次试验才能确定）；
2
、蛋白质最适标记量的确定（将待标<
/p>
记蛋白作一系列稀释后各取一定量加入装有一定量胶体金的试管中，
然后分别加
入
NaCl
溶液，
混匀静置数小时，
对照管与加入蛋白量不足的管颜色会由红变蓝，
而蛋白量足或超过的管保持红色不变，
其中含蛋白最低的一管即为稳
定胶体金所
必须的最适标记量。以此比例并增加
10%-20%
即为标记全部胶体金溶液所需的
蛋白总量）
；
3
、
标记过程（在电磁搅拌棒下
将
1/10
体积的合适浓度的蛋白质溶
液加于胶体金溶液中，反应一定时间后加入
BSA
并调整至
pH8.5
，放置室温继
续反应数分钟）；
4
、离心去除未结合的蛋白质（各粒径的金粒子所需的离心转<
/p>
速与时间均不一样。离心后去上清液，将沉淀用含
PEG
或
BSA
的缓冲液悬浮，
恢复至原体积后再离心。如此洗涤
2-4
次，以彻底除去未结
合的蛋白质）。
NC
膜
硝酸纤维素膜
(nitrocellulose filter
membrane
，简称
NC
膜
)
，在胶体金
试纸中用做
C/T
线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。
国内
NC
膜的分类主要有两种：
135s
和
180s
。分类
是依据现在大部分厂商用
的
4cm
膜平
均水的层析时间。换算为孔径就是
135s=8um
，
180s=6um
。
那么从这个公
式中可以看出，
在通
过同
一长度位置时，金溶液通过的速
度是快速膜
>
< br>慢速膜。那么
通过速度越快和包被在
T
< br>线的物
质反应时间也就
越短，读数快
，那么灵敏度也就越低。反之，
反应时间长，读数慢，也就
灵敏度高。同
时还有一个问题是，反应时间越
长，发生非特异性
结合的可
能性就越大，
所以过长时间的反应不一定就能
够真正的提升灵敏度。所以
这里就有一个
读数时
间
/
反应
灵敏度
/
非特异性
结合的均衡。综合以上，结
论为膜孔径越
小灵敏度越高。但是同时也减慢
了跑板速度，增
加了非特异
性结合的机会
，也就是假阳性的升高。所以要
按照试验结果挑选适合实际
项目的膜，找到合适的平衡
点至关重要。根据专家研究
135s
的一般用在双
抗体夹心法，
180s
的一般用在竞争法<
/p>
。
胶体金免疫分析技术
一、斑点金免疫渗滤试验
原理：
胶体金免疫渗滤分析（
DIGFA
）原理与
操作步骤基本与
ELISA
相同：加
样品于固定有配体（抗体或抗原）
的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形
成抗体
-
抗
原复合物，洗涤渗滤后，再加液体的胶体金标记抗体。当结果
为阳性时，在膜上固定有抗体
-
抗原
-
胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑
点。
技术类型：
1
、双抗体夹心法
用抗体结合在微孔膜中央，滴加待检标本，若
标本中待测抗原与膜上抗体上结合
，然后滴加金标抗体，再加洗涤
剂洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。
2
、间接法
用抗原包被在微孔膜上，滴加待测标本，滴加洗涤剂
洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤
剂洗涤后，阳性者即在膜中央呈
红色斑点（胶体金聚集）。该法由于血清标本中非目的性的
Ig
G
的
干扰，易导致假阳性结果，临床上运用较少。
装置示意图
装置分解图
二、斑点金免疫层析试验
原理：
斑点金免疫层析实验（
DICA
）是胶体金
标记技术和蛋白质层析技术相结
合的以微孔滤膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。
与胶体金免
疫渗滤实
验的过滤性不同，
DICA
中滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作
用向另
一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体
膜上某
一区域的抗体（或抗原）结合而被固化，无关物则越过该区域而
被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果。