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1.
双抗体夹心法
双抗体
夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的
ELISA
，适用于检测分
子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的
检测。
其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶
标抗体分别与样品中被检测抗
原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体
-
抗原
-
酶标抗体免疫复合
物。由于反应系统中
固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的
< br>,
因此复合物的形成量与待测抗原的含量
成正比
(
在方法可检测范围内
)
。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量
(OD
值
)
，
即可确定待测抗原含量。<
/p>
若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗
原分子上两个不同的抗原决定簇结合，
则属于双位点夹心法。
若采用固相载体上的抗原和酶
标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则
是双抗原夹心法。
操作步骤：
⑴将特异性抗体包被固相载体
McAb
。孵
育一定时间，使形成固相抗体，洗涤除去未结
合的抗体和杂质。
⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原
抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
⑶加酶标抗体，孵育，使形成固相抗体
-
待测抗原
-
酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结
合酶标抗体。
⑷加底物显色。固相上的酶催化底
物产生有色产物
,
通过比色
,
测标本中抗原的量。
现多采用针对单一抗原决
定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体，
则受检样品和
酶
标抗体可一次性加入，
简化流程，
缩短反应时间。若标本中待测
抗原浓度过高，
抗原可分
别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成
上述夹心复合物
(
类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时
的后带现象
)
，
使最终结
果低于实际含量
(
钩状效应
)
，
甚至出现假阴性现象。
因此对此类标本
应适当稀释后再测定。另外，当血清中存在类风湿因子（
RF
）时，类风湿因子（
RF
）可充
当抗原，而形成固相抗体
-
类风湿因子
-
酶标抗体夹心复合物，从而出现假阳性结果。
2.
间接法
此法是测定抗体最常用的方法
,
属非竞争结合试验。
其原理是将抗原连接
到固相载体上，
样品中待测抗体与之结合成固相抗原
-
受检抗体复合物，再用酶标二抗
(
针对受检抗体
的抗
体，如羊抗人
IgG
抗体
)
与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原
-
受检抗体
-
酶标二
抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。
操作步骤
⑴将已知抗原包被固相载体
,
形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵封闭
:
用高浓度无关蛋
白封闭
,
阻止待检血清中非特异
IgG
吸附固相。
⑶加待检血清，
孵育，
使固相抗原和待检抗体充分结合，
洗涤除
去未结合的非特异抗体
及其他血清成分。
⑷加酶标抗体或酶标
SPA
，孵育，形成固相抗原
-
待检抗体
-
酶标抗抗
体
(
或酶标
SPA)
< br>复
合物。
⑸加底物显色。
间接法由于采用的酶
标二抗是针对一类免疫球蛋白分子
(
如抗人
IgG),
因此该法只需要
换固相抗原，即可用一种酶标二
抗检测各种与抗原相应的抗体，具有更广泛的通用性。
1
3.
竞争法
竞争法
ELISA
可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检
测。其方法和特点
是：
①酶标记抗原
（
抗体）
与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体
（抗
原）结合的能力；②反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定
限量，且前
者的结合位点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和；
③免疫反应后，结合于固相载
体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶
活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗
体）的浓度成反比。
操作步骤
⑴将已知抗体包被载体
,
形成固相抗体。洗涤除去未结合物。
<
/p>
⑵加入待检标本和酶标抗原，
孵育，
使两
者与固相抗体竞争结合。
洗涤除去未结合到固
相上的游离酶标抗
原及其他未结合物。
⑶加底物显色。颜色深浅与待测抗原量成反比。
同理，
也可用固相抗原和酶标抗体作试剂，
使固相抗
原和标本中的待检抗原竞争结合酶
标抗体。待检抗原竞争抑制酶标抗体和固相抗原结合，
即待检抗原越多，显色越浅。
以抗原测定为例，
先将特异性抗体连接于固相载体，
分别设置对照管和样品测定管；
对
照管中仅加酶标抗原，加样后，
无非标记抗原竞
争，酶标抗原即与固相抗体充分结合；
而测
定管抗原与后者的结
合受到抑制而减少。
加酶底物显色后，
对照管因固相抗体上结合
的酶标
抗原多，
显色深，
测定管则依被
检抗原和酶标抗原竞争结合固相抗体程度不同而显色深浅有
异：被检抗原多，酶标抗原与
固相抗体结合少，底物显色反应弱，色浅；反之呈色深。即结
合于固相的酶标抗原量与样
品中被检抗原浓度负相关。计算测定管与对照管颜色深度（
OD
值）之差，即可确定被检抗原量。
4.
捕获法
捕获法（亦称反向间接法）
ELIS
A
，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如
IgM
）的
测定。以目前最常用的
IgM
< br>测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性
IgM
和
IgG
同时存
在，则后者可干扰
IgM
的测定。因此捕获法的工作原理设计为：先将针对
< br>IgM
的第二抗体
（如羊抗人
I
gM
μ
链抗体）连接于固相载体，用以结合（
< br>“捕获”
）样品中所有
IgM
（
特异或
非特异）
，洗涤出去
IgG
等无关物质，然后加入特异抗原与待检
IgM
结合；再加入抗原特异
的酶标抗体，
最后形成固相二抗
- IgM-
抗原
-
酶标抗体复合物，
加酶底物作用显色后，
即可对
样品中待检
IgM
是否存在及其含量进行测定。
5.
其他
ELSA
ELSA
法由于测定灵敏、
特异、
操作简便、
易
于自动化，
且无放射性污染等诸多优点，
使其不仅成为目前应用
最广而且发展最快的一种免疫测定技术。
而且在方法学上的改进和衍
化，使其不断有各具特点的新测定法问世，如应用生物素
-
亲和素放大系统（
biotin-axidin
system
，
BAS
）的
ELISA
；利用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定（
en
zyme
linked
immunofluorecence
assay
，
ELFIA
）
，斑点<
/p>
-ELISA
（
dot-ELISA
）和酶联免疫电转移印迹法
（
enzyme
linked
immunoelectrotransfer
blot
，
EITB
< br>）以及酶联免疫化学发光测定（
enzyme
linked immunochemiluminescence assay
，
ELICLA
）等。新方法不仅进一步提高
了测定灵敏、
特异性，而且使
ELISA
技术在提高自动化程度的同时，也便于单份样本测定和简化设备条
件，尤其试用于急诊
、社区诊所及家庭化验。
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