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自噬双标腺病毒（
mRFP-GFP-
LC3
）使用指南
自噬双标腺病毒（
mRFP-GFP-
LC3
）使用指南
背景：
自噬是细胞内的一种
“
自食
（
Self-eating
）
”
的现象，
凋亡是
“
自
杀（
Self-kil
ling
）
”
的现象，二者共用相同的
刺激因素和调节蛋白，
但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚
.
自噬是指
膜（目前来源还有争议，大部分表
现为双层膜，有时多层或单层）包
裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、
蛋白质等形成自噬体，
最后与
溶酶体融合形成自噬溶酶
体，
降解其所包裹的内容物，
以实现细胞稳
态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略
和手段有：通过
western blot
检测
LC3
的剪切；通过电镜观测自噬体
的形成；
在荧光显微镜下采用
GFP
（
-RFP
）
-LC3
等融合蛋白来示踪自
噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，
针对于此我们
汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬
(
流
)
的
mRFP-GFP-LC3
腺病毒，
mRFP
用于标记及追踪
LC3
，
GFP
的减弱可指
示溶酶体与自噬小体的融合形成自
噬溶酶体，即由于
GFP
荧光蛋白对
酸
性敏感，当自噬体与溶酶体融合后
GFP
荧光发生淬灭
,
此时只能检
测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了
细胞自噬流的水平，
是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利
器。
< br>
1
汉恒生物科技
(
上海
)
有限公司
400-092-0065
地址：上海市徐汇区斜土路
1
175
号景泰大厦
1503
实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器
1
号楼
314
汉恒生物科技
邮箱：
service@
自噬双标腺病毒（
mRFP-GFP-
LC3
）使用指南
mRFP-
GFP-LC3
腺病毒的操作
收到病毒后的处理
（一）、腺病毒的储存
1
、腺病毒采用冰袋运输。
（
1
）
、
收到病毒液后如未融化请置于
-80
℃冰箱，
下次使用时再进
行分装；
< br>（
2
）
、
如客户收到时腺病毒已融化，
请直接分装后置于
-80
℃冰箱
保存；
若短期内用于实验，
可分装部分于
4
℃保存
（
尽量一周内用完）
。
2
、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病
毒滴度
10%
）。建议不要在
-20
℃下长期保存。如果病毒储存时间超
过
6
个月，应该重新测定病毒滴度。
3
、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的
小包装病毒产品
（购买时请提出）。
（二）、腺病毒的稀释
需要稀释病毒
时，
将病毒取出后置于冰上融解，
使用培养目的细胞
用
PBS
或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后<
/p>
4
℃保存，
并尽快用于
< br>实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释，
并尽快用完。
感染目的细胞
2
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由于腺病毒是自主
复制性基因载体，不能插入基因组稳定遗传，
因此实验中细胞感染腺病毒的实验需要具体
情况具体对待。
一般根据
外界刺激处理的时间来选择感染腺病毒
的时间，
短时程处理
（一周之
内）
建议先感染腺病毒之后再进行处理，
长时程刺激的建议在刺激结
束前
2~3
天进行腺病毒感染。另外不同细
胞的
MOI
不同，所以在将
病毒感染正
式感染目的细胞前，
需要做一个预实验以确定目的细胞中
加入的
病毒数。
（一）细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到
24
孔板，
使细胞浓度为
1
×
1
0
5
/ml
细胞，
接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，
一般是保证第二
天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于
50%
至
70%
直接。
（二）病毒感染
I
、贴壁细胞
由于该病毒感染后续拍照需要进行自噬小点的计算，
因此需要在
高倍镜下拍照，
条件允许最好使用共聚焦显微镜拍照，
此时需
要把细
胞铺被在玻片上面
（部分细胞铁壁能力不是很强，
此时需要预先在玻
片上包被
galetin<
/p>
甚至
laminin
）。感染实验在
1/2
体积培养液感染
（详见下表格）
。加入的病毒量范围在
MOI=20
～
50
内
（具体感染的
操作量参见附录表格）
，每个
MOI
值加两个孔
2
小时后换液。
3
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培养皿
类型
96-well
24-well
12-well
6-well
60mm
100mm
病毒小培养体积感染表
表面积
对应细胞培养液体积
病毒感染对应细胞培
养液体积
/cm
2
0.3cm
2
2cm
2
4cm
2
10cm
2
20cm
2
60cm
2
100ul
500ul
1ml
2ml
4ml
10ml
50ul
250ul
500ul
1ml
2ml
5ml
感染
2
小时后直接换液
II
、悬浮细胞
上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细
胞，
< br>则需要通过平角离心转染法，
即将适量的病毒液加入细胞培养皿
< br>后，封好口，放入平角离心机后，低速离心
1h
，然后放
入培养箱中
正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管
代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，
然后
加入适量的病毒液，室温放置
10min
（不能超过半小时），
然后
将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染至
2<
/p>
小时后换
液即可。
（三）观察感染情况
感染
24
小时后，可以开始观察到
GFP
以及
RFP
表达，
36-4
8
小时
可以进行细胞固定、封片（需要使用防淬灭的固定剂）、
拍照分析。
（四）结果分析
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