-
microRNA
的作用规律及其在细胞生物学研究中的应用
摘
要:
MicroRNA(miRNA)
是一类由内源基
因编码的长度约为
22nt
的非编码单链
RNA
分子,它参与细胞转录后基因表达调控。
miRNA<
/p>
高度的保守性与其功能的重要性有着
密切的关系。本文着重讨论了
microRNA
的作用规律,包括它的生成、作用模式、作用
机制;及其在细胞生物学研究中的应用,包括
miRNA
在基因沉默、细胞周期调控、对
细胞分化的作用和在信号通路中的作用
及其在细胞生物学研究中的应用。
miRNA
在细
胞分化,
生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用,
定量测量
miRNA
的表达水平,
可以帮助人们对其功能和作用机制的了解。
关键词:
miRNA
;
miRNA
的生成;作用规律
MicroRNA(miRNA)
是一类由内源基因编码的长度约
20~24nt
的非编码单链
RNA
分
子,
在细胞内发挥调节基因表达的作用,
主要是裂解互补的
< br>mRNA
或是抑制它的翻译,
与许多疾病相关。它是植物
、动物、病毒分子,甚至是单细胞有机体、绿藻、衣藻中的
基因调控分子。
第一个被确认的
miRNA
是在线虫中首次发现的<
/p>
lin-4
和
let-7
,
到目前为
止,在包括人类、果蝇、植物等多种生物物
种中已经鉴别出有
4361
个
miRN
A
分子。大
多数
miRNA
基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。对
miRNA
p>
表达
水平的定量可以帮助理解它的作用机制。
miRNA
在各种生物体之间具有保守性,使它
的来源丰富<
/p>
[1]
。
本文着重讨论了
microRNA
的作用规律及其在细胞生物学研究中的应用。
一、
miRNA
特征
miRNA
具有高度的保守性、时序性和组
织特异性。在各个物种间具有高度的进化
保守性,
并且在茎部的
保守性最强,
在不同组织中表达有不同类型的
miRNA
。
在线虫,
果蝇,小鼠和人等物种中已经发现
的数百个
miRNA
中发现,在不同组织、不同发育阶
段中
miRNA
的水平有显著差异,这种
miRNA
表达模式具有分化的位相性和时序性。
miRNA
不仅在基因位置上保守,序列上也呈现出高度的同源性。同时,每个
p>
miRNA
可
以有多个靶基因,而几个
p>
miRNA
也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以
p>
通过一个
miRNA
来调控多个基因的表达
,也可以通过几个
miRNA
的组合来精细调控
某个基因的表达。
大多数研究表明基因组中存在
p>
60-90nt
的发夹结构,称为
RNA<
/p>
发夹。
miRNA
转录
< br>的前体也存在发夹结构,根据来二级结构域区分
miRNA
发夹序列和其他部分的发夹结
构
[2]
。其
5
'端第一个碱基对
U
有强烈的倾向性,而对
G
却有抗性,但第二到第
四个碱
基缺乏
U
,一般来讲,除第四个
碱基外,其他位置碱基通常都缺乏
C
。在
3
'端有
1~2
个碱基长度变化,它
不编码蛋白质,本身不具有开放读框。成熟的
miRNA5
'端
有一个
磷酸基团,
3
'端为羟基,是与
相同长度的功能
RNA
降解片段相区分的标志。
二、
miRNA
的作用规律
的生成
<
/p>
据体内外实验研究表明
miRNA
的生成
至少需要两个步骤:
(
1
)在
RNA
聚合酶Ⅱ的作用下从
< br>DNA
转录一个原始内源性转录本
miRNA(pri<
/p>
-
miRNA)
。由
pri-miRNA
生成
70nt
左右的
miRNA
前体(
pre-mi
RNA)
,该过程发生在细
胞核。
Pr
e-miRNA
是由内源性基因间区或内含子的
DNA
反向重复序列转录而来。它是
非编码
RNA
p>
,具有茎
-
环结构。
(
2
)将
pre-miRNA
加工为成熟
miRNA
。该过程发生在细胞质中。
Pre-miRNA
在
Dicer
的作用下被裂解成瞬时
miRNA<
/p>
双体。
这种双链
miRNA
分子很快与包括
Argonaute(Ago)
蛋白
在内的其他多种蛋白质结合,参与构成
RNA
诱导沉默复合物<
/p>
(RNA
—
inducedsilenc
ingcomplex
,
RISC)
。
具体的过程是:
MiRNA
是在
DNA
聚合酶Ⅱ的作用下从
DNA
转录
miRNA
基因生
成
pri-
miRNA
。
生成的
pri-miRN
A
经
RNase
Ⅲ
-Drosha
加工释放发夹中间体
pre-miRNA<
/p>
。
然
后由依赖
R
NA
的核转运受体家族成员输出蛋白
-5(Exportin5
)
将
pre-miRNA
运出细胞核。
到达细胞质后,
pre-miRNA
在
RNase
Ⅲ
Dicer
的作用下进行第二次加工,
pre-miRNA
被<
/p>
裂解成瞬时
miRNA
双体,生成的
p>
miRNA
∶
miRNA*
双螺旋中,只有
miRNA
单链可以
< br>选择性结合到
RNA
诱导的沉默复合体。
它的一条链通过未知
RNA
酶降解,
< br>而另一条链
保留成为成熟的
miRNA
< br>,参与构成
RISC
[3]
。<
/p>
最新的研究表明,
miRNA
的前体加工还存在不依赖于
Dicer
的其他途
径,例如
pre-miR-451
可以形成特殊的二级结构,直
接被
Ago2
所识别并切割加工形成成熟体
miRNA
[4]
。
与靶
mRNA
的作用模式
miRNA
通过调节靶基因的表达水
平影响细胞分化、
增殖、凋亡等特性,
在生物的生
长发育和疾病发生发展中发挥重要的作用。
miRNA
作用通路研究表明,作用通路作用
模式有:
宿主基因与内含子
miRNA
共同抑制一个基因功能;
同
一个基因簇内的
miRNA
共同抑制两个相关的蛋白编码基因;
两个宿主基因与各自的内含子
miRNA
基因形成双
向负调节回路
[5]
。
绝大多数
miRNA
通过与靶
mRNA
的互补配对,在转录后水平沉默基因的表达从而
使细胞表型发生改变。在人基因组中已鉴定出上千个
miRNA
,根据软件预测,约
60%
基因的
3
'
非翻译区
(untransl
atedregion
,
UTR)
都有
miRNA
的结合位点。
每个
miRNA
可
以调控多个靶基因,
而几个
miRNA
可协同调控同一靶基因,
miRNA
实现的是一种宏观
而又精细的调控。
RISC
作用模式分为
3
种:
(
1
)以线虫
lin-4
为代表,作用时与靶标基因不完全
互补结合,进而抑制靶
mRNA
的翻译而不影响它的稳定性,此
种方式在动物中多见;
(
2
)以拟南芥
miR-171
为代表,作用时与靶
标基因完全互补结合,作用方式和功
能与
siRNA
非常类似,最后降解靶
mRNA
,此种方式常出现
于植物中;
(
3
)以
let-7
为代表,当与靶标基因完全互补结合时直接
靶向切割
mRNA
,如果蝇
和
HeLa
细胞中
let-7
直接介导
RISC
分裂切割靶
mR
NA
;
当与靶标基因不完全互补结合
时
,起调节基因表达的作用,如线虫中的
let-7
与靶
mRNA
的
3
'端非翻
译区不完全配
对结合后,阻遏调节基因的翻译
[5]
。
虽然绝大多数
miR
NA
需要与
Ago
蛋白结合后才能发挥
功能,但最新的研究表明,
miR-328
可以直接结合
hnRNPE2
,
从而解除
< br>hnRNPE2
对
C/EBP mRNA
的翻译抑制作用,
最终促进髓系祖细胞向粒细胞的分化
[6]
。
作
用机制
[7]
除已明确的
mRNA
降解和衰减机制外,
还陆续提出了翻译起
始抑制,
翻译起始后抑
制,
P
小体
(processingbody)
、应激
颗粒
(stressgranule)
颗粒扣押靶
mRNA
、去抑制和激活
等作用。
< br>
(
1
)
miRNA
抑制翻译的起始
在含有
m7Gppp
帽子结构的
mRNA
p>
,含有内部核糖体进入位点
(internalribosomee
ntrysite
,
IRES)
和含有
ApppN
帽子结构的三种
mRNA<
/p>
中,
只有
m7Gppp
< br>帽子结构的
mRNA
可以被
mi
RNA
抑制,说明
m7Gppp
的帽子
结构是
miRNA
介导的翻
译抑制是必
需的。
另一方面,核糖核蛋白复合体
(miRNP)
中聚集了某些帽子结构结合蛋白或者
mRNA<
/p>
翻译起始过程中,干扰
eIF4E-eIF4G
< br>相互作用的蛋白质,从而使
40S
核糖体小亚基不能
p>
结合到翻译起始复合物中。
(
2
)
miRNA
的起始后
抑制
科学家提出
miRNA
介导的抑制发生在翻译起始后的步骤,
即
miR
NA
降低了翻译延
伸的速度。关于
mi
RNA
抑制翻译的起始后过程仍需要进一步的证据。
(
3
)
miRNA
p>
与
mRNA
的
3<
/p>
’
UTR
以外的区域结合
有研究表明,
miRNA
还
可以结合基因的编码区和
5
’
UTR<
/p>
区,
miRNA
通过与靶基因
的启动子和
5
’
UTR<
/p>
区结合激活某些基因的表达。近来还有证据表明,
miRNA
p>
除了调控
编码基因还负调控一组非编码基因
UCG
的表达,
UCG
是人基因组中的
一种非编码基因,
在脊椎动物中高度保守。因此,
miRNA<
/p>
的异常表达不仅会导致编码基因表达的失调,
其非编码基因的表达
也会受到影响。
(
4
)
miRNA
介导的
mRNA
降解与
P
小体有关
P
小体是真核细胞细胞质中的
R
NA
颗粒体,其中富含降解
mRNA
的
蛋白质和翻译
抑制子,被认为是细胞的
mRNA
代谢场所。比如在肝细胞中,
CAT1mRNA
被肝特
异性
miR-122
所沉默,随即聚集在
P
小体中,当氨基酸饥饿或者其他应激状况下,
HuR
蛋白
可以通过促进
miRISC-
靶
mRNA
复合体解离和
P
小体解聚,去除
miRNA
的抑制作
用
)
由细胞核进入细胞质中,与
CAT
1mRNA
的
3
’
UTR
区结合,使
CAT1mRNA
由
P
小体中
释放出来进入多核糖体进
行翻译。
RNA
结合蛋白也可以解除
miRNA
对其靶基因的抑制作用。比如,
miR-430
在体细
胞中抑制
n
anos1
和
tdrd7
的表达,而在
生殖细胞中却无此作用,这是因为在生殖细胞中
RNA
结合蛋白
结合到
nanos1
和
tdrd7
p>
的
3
’
UTR
p>
区导致
miRNA
无法与之结合而致。这<
/p>
样,
RNA
结合蛋白在
< br>miRNA
介导的基因表达调控中作为激活子存在。
<
/p>
(
5
)
miRN
A
可激活靶基因的表达
miRNA<
/p>
对靶基因可从正负两方面进行调控,
miRNA
< br>激活作用与富含腺嘌呤
/
尿嘧啶
元件
(AUrichelement
,
ARE)
相关,
ARE
存在于多种细胞
因子,
癌基因,
生长因子的
3
’
UTR
区,
ARE<
/p>
是
miRNA
活化翻译的信号,在饥饿等
环境因素影响下,可促进靶基因
mRNA
的降解。在
miRNA
指导下,
miRISC
复合物成员如
Ago
、
FXR
P
被招募到
ARE
上,激
活翻译、上调基因表达。
(
6
)
miRNA
对靶基因的去抑制作
用
研究发现在鼠的神经元细胞中,
m
iR-134
抑制了
limk1
的表达
,而当
BDNF
因子刺
激神经元细胞时
,
miR-134
从
lim1mRNA
中释放出来,解除了
miR-134
对
lim1mRNA
的抑制作用。在果蝇中,
miR-280
和
miR-289
所调控的靶基因之一是钙调蛋白依赖的蛋
白激酶Ⅱ
(CaMK<
/p>
Ⅱ
)
,在接受嗅觉刺激后,
CaMK
Ⅱ在突触后位点翻译被活化。
Ashraf
等
发现这个活化翻译的过程是与
arm
itage(RISC-miRNP
复合体的解旋酶
)
的蛋白酶介导的
蛋白质水解有关,说明
CaMK
Ⅱ翻译的活化是
miRNA
去抑制的过
程。
调控基因表达的特点
(
1
)部分
miRNA
成簇表达
约有
37
%
的
miRNA
基因是成簇分布在基因
组中,
这些基因簇中的
miRNA
基因
有的
共享同一套调节序列,来源于一个转录物;有的
miRNA
基因簇中的
miRNA
来源于独
立的转录物,比如
miR-433
和
miR-127
。另外,一个
miRNA
基因通过双向转录还可以
产生两个不同的
mi
RNA
,分别调控不同的靶基因
有些
基因簇中的
miRNA
在功能上相关的,共同靶向同一基因或者
同一基因家族,
或者靶向了同一条信号通路中的不同组分,同一基因簇中的
miRNA
调控功能上相关的
蛋白质,另外,同一<
/p>
miRNA
家族中的成员有可能有相似的功能可能参与相似的生物
学
过程。
(
2
)组织特异性
miRNA
miRN
A
的表达有时间特异性和组织特异性。通过对人和鼠的成体器官的
miRNA
表
达谱分析发现,约
50
%
的
miRNA
是组织特异性的表达方
式。对斑马鱼各组织进行原位
杂交发现多数组织特异性的
miR
NA
在发育过程中存在时间特异性。
与编码蛋白质的基因一样,组织特异性的
miRNA
的表达也受
复杂的转录因子系统
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