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一种高效实现多片段插入的重组质粒的构建方法

作者:高考题库网
来源:https://www.bjmy2z.cn/gaokao
2021-02-27 21:26
tags:

-

2021年2月27日发(作者:minority)


高效构建一种多片段插入的疟原虫基因敲除重组质粒



刘权兴






谭章平





徐文岳





戴纪刚



【摘要



目的



构建一种基因敲除重组质粒,在


PL0007

< br>质粒中实现多个片段的无缝插入。


方法



首先,设计融合


PCR


引物,在各片段之间的引物设计


15bp


重叠序列,并且在第一个


插入 片段的


5’


端和最后一个插入片段的


3 ’


端也要与载体上重叠


15bp


。其次 ,运用常规


PCR


方法扩增出待融合片段,并进行胶回收纯化。 应用融合


PCR


技术将要插入的各个片段拼接

< br>到一起成为一个大片段。最后,应用无缝克隆试剂盒将该大片段插入


PL0007


质粒的特定位


点。


结果



经酶切鉴定和


DNA


测序证 明所构建的重组质粒完全正确,插入序列碱基无一突


变。


结论< /p>



联合应用融合


PCR

< br>技术和无缝拼接技术可以高效的在质粒载体中连续无缝插入多


个片段,阳性率比传 统技术更高,操作更方便。



[


关键词


]


:重组质粒、融合


PCR

< p>
、无缝拼接



[


中图分类号


] R382.3+1



A highly efficient method for the construction of recombinant plasmid



with several DNA fragments insertion for knockout


Plasmodium genome



[Abstarct]



Objective


In this study, we describe a general method for plasmid assembly that uses


infusion


method


to


insert


three


DNA


fragments


into


plasmid


PL0007.


Methods



At


first,


we


designed the fusion PCR primers, which request 15bp overlap sequence between the primers, and


the first insertion fragment of the 5' terminal and the last insertion fragment of the 3' terminal also


overlap 15bp with the vector. Secondly, infusion fragments, amplified by PCR and purified with


the Gel Extraction Kit, were infused into a integrated fragment with


the method of fusion PCR


technology and then inserted into the target site in the plasmid PL0007 with the Infusion Kit. At


last,


the


recombinant


plasmid


was


proved


entirely


correct


with


no


mutation


in


the


sequence


of


bases


by


restriction


enzyme


digestion


and


DNA


sequencing.


Results



Restriction


endonuclease


reactions


was


used


to


identify


the


recombinant


plasmid


and


followed


by


sequence


analysis.


All


recombinant


plasmid


are


right


and


without


a


mutation


point


in


the


inserted


fragment.


Conclusion



Combined with fusion PCR technology and fusion PCR technology may insert m


μl


tiple fragments


into plasmid vectors with high efficacy and more convenient, and the positive rate is higher than


the traditional technology.


[Key words]


recombinant



plasmid; infusion PCR reactions; homologous recombination






























随着基因测序技术的日益成熟,< /p>


多种生物的全基因组测序已经完成,


功能基因组学已成

< p>
为时下研究的热点


[1]



构建重组质粒在细胞中插入某些基因使其表达及进行基因敲除是研究


基因功能的重要方 法


[2]


。然而传统的酶切连接的方法只对于质粒中单片段的插 入较为合适,


当涉及到要在质粒中连续插入多个片段时往往需要设计多个酶切位点,


并且不可避免地在片


段与片段之间引入无关酶切位点,


这可能会影响插入片段的表达。


有时还会因找不到合适的

酶切位点而无法构建出目的重组质粒。


为了克服传统方法的缺陷出现了以聚合酶链反 应为基


1


础的实现多片段拼接的技术即融合

PCR


技术,


在质粒构建方面也出现了基于同源序列同源< /p>


重组反应的无缝克隆技术。融合


PCR


技 术


[3-5]


在无需限制性内切酶和连接酶的情况下,通过


具有同源互补序列的引物将各需要拼接的片段单独扩增出来,


同时以 两单独片段共同作为模


版,再加入首尾两端的引物再进行一轮


P CR


即可将任意两片段实现无缝拼接。这种技术只


适用于构建一 些线性化的


DNA


片段,无法实现重组质粒的构建。无缝克隆技 术


[5,


6]


是指通


过在设计插入片段引物时在


5’


端引入载体上的一段同 源序列扩增出与载体有一定


(15bp)


源序列的插入片段,


进而通过重组酶的作用将插入片段无缝拼接入载体质粒中。


理论上该方


法可以实现单片段和多片段拼接,


但在实际应用中发现单片段拼接时效率较高,


随着拼接片


段数 量的增加同源重组效率会大大降低,有时很难得到阳性结果。



鉴于目前多片段重组质粒构建普遍存在的问题,本研究对联合运用融合


PCR

< p>
技术和无


缝克隆技术构建多片段重组质粒的方法进行了探索。成功构建了三 片段同时插入


PL0007



粒的一种 基因敲除重组质粒。


并对多片段融合与无缝克隆的操作步骤、


反 应条件、


技术要点


进行了详细地论述。



与普通


PCR


反应相比,本实验的融合


PCR


反应改进了引物浓度,模版浓度,延伸时间


等条件。本实验以构建伯氏疟原虫基因敲除及替换重组质粒为例。在


PL00 07


质粒中插入敲


除序列


5’UTR< /p>



3’UTR


,以及表达序列

< p>
mouseMAGE-A3



gfp-

< p>
3’pbdhfr/ts



(如图


1





1




材料与方法:




1


作者简介:刘权兴,硕士研究生,主要从事肺癌的基础和临床 研究。



通讯作者:戴纪刚,新桥医院胸外科副主任医师,


E-mail:


691057831@



基金资助:国家自然科学基金面上项目


(


项目批准号


:81172238)



1.1


质粒与菌株




基因敲除所用的


PL0007


质粒、


PL0017


质粒由美国


NIH


苏新专教授惠赠,


DH5α

< br>感受态购自北京天根生化科技有限公司。



1.2


培养基




细 菌培养基


SOB


培养基、


2-YT


培养基(见萨姆布鲁克主编分子克隆实验指南


第三版)


;细胞培养基


DMEM


、胎牛血清购自


Hyclone


公司。



1. 3


试剂




PCR


用的聚合酶

< br>KODFX



KODPlus


均 购自日本


TOYOBO


公司;无缝克隆试剂


infusion


、反转录试剂盒、

Quickcut


限制性内切酶切酶


Bgl



,


Pst



,


Xho


Ⅰ,分子量标准


DL 2000


Marker


均购自日本


T akara


公司;


RNA


提取试剂盒、 胶回收试剂盒、质粒提取试剂


盒购自美国


OMEGA

< p>
公司;


500bp DNA ladder



1Kb DNA ladder


均 购自北京天根生化科技


有限公司;胎牛血清购自美国


Hyclo ne


公司。



1. 4


细胞与虫株




LLC


细胞系购自上海中科院细胞库,伯氏疟原虫


ANKA< /p>


株(


Plasmodium


berghei


ANKA,


P


.b


)由本实验室保存。



1.5


提取


LLC

< br>细胞培养及


cDNA


提取




首先,


用细胞培养瓶培养

< p>
LLC


细胞系,


培养液为含


10%


胎牛血清的


DMEM


培养基, 培养条件为


37


℃、


5%



CO


2


孵箱。待其


LLC


细胞铺满瓶


底后,常规胰酶消化。


1000g


离心


5min

< br>,弃上清。运用


RNA


提取试剂盒提取

< br>LLC


细胞总


RNA


然后立即运 用反转录试剂盒将其转录为


cDNA



-20


℃保存。



1.6


伯氏疟原虫基因组提取



< p>
取疟原虫感染的昆明小鼠全血约


100


μl


,用


1 ml 1%




saponin / PBS



37







< p>


30min



加入


400


μl



消化缓冲液,


2


μl




白酶


K (20 mg / ml)


至终浓度为


100


μg/ml



待蛋白消化完全后用酚


/

< br>氯仿


/


异戊醇法抽提基因



DNA


。获得的基因组


DNA



-20


℃保存。



1.7


引物设计




根据不同的模版设计相应的引物,融合


PCR


主要用于拼接


5’UTR


、< /p>


mouseMAGE-A3



3’pbd hfr/ts


三个片段长度分别为


800bp,960bp



1209bp


。所有引物由上

< p>
海英骏生物技术有限公司合成。


其中小写部分为相邻片段同源序列,


大写部分为引物特异性


结合序列


(

< p>
表一


)




表一



目的片段扩增所用引物



引物类型



FW


引物序列



tgattacgccaagctagatctGCATTAGCATAACATCTC


模板



P


.b


ANKA


基因组



目的片段



P.b 5’UTR



RV


FW


atgggaatcagccatCACTTTCATATATTTGTTATTTG


acaaatatatgaaagtgA


TGGCTGA


TTCCCATAACACC


LLC


细胞


cDNA


mouseMAGE-A3


RV


FW


RV


FW


cctttactcatggatccGAATGTGTGTAGGTCAGAGG < /p>


gacctacacacattcGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC


agaattaagctgggctgcagGTTGAATTCGAGCTCGGTA C


ttcgggtaccctcgagCATATGTTTGTGTAACATC


P


.b


ANKA


基因组



P.b 3’UTR



Pl0017


质粒



gfp-


3’pbdhfr/ts



RV


tatcgctagcctcgagTGTGCTTAAATGTTTCTTTAAAC


1.8


待融合片段的独立扩增




按常规


PCR


方法对个片段进行独立扩增,扩增使用酶为


KODFX


个片段 的扩增条件见(表二)


。扩增产物用


1%


的琼脂糖凝胶电泳检测,确定目的条


带。切胶,用


OMEGA


胶回收试剂盒回收。



表二



KOD FX


扩增的反应条件



目的片段



P.b 5’UTR



mouse MAGE-A3


gfp-


3’pbdhfr/ts



P.b 3



UTR


引物用量



10pmol


10pmol


10pmol


10pmol


反应条件


< p>
35cycles(94



20s;64



30s;68



50s)


35cycles(94



20s;64



30s;68



60s)


35cy cles(94



20s;64



30s;68



75s)

< p>
35cycles(94



20s;64




30s;68




50s)


片段长度



800bp


960bp


1209bp


759bp


1.9


融合


PCR


反应




测定个片段胶回收产物的浓度,


PCR


反应体系使用


KODPlus



(


高保


真性


)



25


μ


l< /p>


融合


PCR


体系中加入需拼接的两片段各


50ng


,引物浓度降低到


2.5pm ol/L


,反


应后得到两片段拼接产物,


以此产物进行胶回收将获得的融合片段再与第三个片段进行融合


PCR


反应,从而得到三片段拼接全长片段。具体反应条件见表三。



表三



融合


P CR


反应条件



待融合的片段



P.b 5’UTR



mouse MAGE3


添加引物



P.b 5’UTR FW



mouse MAGE-A3 RV


引物用量



2.5pmol


2.5pmol


2.5pmol


反应条件



35cycles(94< /p>



20s;64



30s;68



110s)


3 5cycles(94



20s;64



30s;68



3min)


gfp-


3’pbdhfr/ts RV



2.5pmol


融合产物



长度



P


.b



5’UTR


-mouse


1760bp


MAGE3


P


.b



5’UTR


-mouse


MAGE3 -gfp-


3’pbd


hfr/ts


2969bp


P.b


5’UTR


-mouse


P.b 5’UTR FW



MAGE3


gfp-


3’pbdhfr/ts



1.10


无缝克隆方法拼接及重组质粒的转化



在引物设计之初就已经在融合片段两端加入了


双酶切(


Bgl< /p>



/


Pst


Ⅰ) 后的线性化载体两端的


15bp


同源序列,基于同源重组的原理 ,在


infusion


重组酶的作用下将上述融合片段连接到< /p>


PL0007


载体中。反应


15min< /p>


后将重组产物


常规转化大肠杆菌(


DH5 α




4000r/min

< p>
离心


3min


,去上清


8 00


μl


,


用枪头将菌液和剩余上清< /p>


吸打混匀全部涂布在含氨苄青霉素


100


μ


g/ml



LB

平板上


,37


℃倒置培养


16


小时候,挑菌、


2-YT


培养基摇菌。进行 菌落


PCR


初步鉴定。




1.11


重组质粒的鉴定




对菌落


PCR


获得的阳性菌液,


进行运用质粒抽提试剂盒进行质粒抽


提纯化 。


将获得的所有质粒进行酶切鉴定,


并进一步对插入片段进行测 序。


重组质粒一运用


Bgl



/


pst


Ⅰ双酶切鉴定,重组质粒二分别运用< /p>


Bgl



/


Ps t


Ⅰ双酶切和


Xho




单酶切鉴定。插


入片段的测序由上海英骏生物技术有 限公司完成。




2




结果



2.1


成功获得待插入


DNA


片段



插入片段有三个独立的片段构成:


5’UTR



mouse MAGE3



gfp-


3’pbdhfr/ts


。片段长度


分 别为


800bp



960bp



1209bp


(如图


1a




其中


5’UTR


是疟原虫基因组中的一段序列、


mouse


MAGE3


为一段肿瘤特异性抗原基因、


gf p-


3’pbdhfr/ts


为一段荧光蛋白基因及其终止序列 。


电泳分析结果表明两次融合


PCR


扩 增产物长度分别为


1760bp



29 69bp


,与预期结果相符


(如图


1b



1c



。产 物条带清晰,特异性强,无其他非特异性扩增。实验重复了三次均获得


目的片段。

















(a)


























(b)























(c)


(a)


M



DL2000 Marker



1



5’UTR




2



mouse MAGE3




3



gfp-


3’pbdhfr/ts




(b)


M



500bp Marker





1



5’UTR





2



mouse MAGE3



3



5’U


TR




mouse MAGE3



片段融合产物




(c)


M



500bp Marker




1



5’UTR




mouse MAGE3


段融合产物



2



gfp-


3’pbdhfr/ts





3



5’UTR


/m ouse MAGE3



gfp-


3’ pbdhfr/ts


两片段融合产物




1


融合


P CR


反应核酸电泳分析



2.2


重组质粒一的成功拼接


-


-


-


-


-


-


-


-



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