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高效构建一种多片段插入的疟原虫基因敲除重组质粒
刘权兴
谭章平
徐文岳
戴纪刚
【摘要
】
目的
构建一种基因敲除重组质粒,在
PL0007
< br>质粒中实现多个片段的无缝插入。
方法
首先,设计融合
PCR
引物,在各片段之间的引物设计
15bp
重叠序列,并且在第一个
插入
片段的
5’
端和最后一个插入片段的
3
’
端也要与载体上重叠
15bp
。其次
,运用常规
PCR
方法扩增出待融合片段,并进行胶回收纯化。
应用融合
PCR
技术将要插入的各个片段拼接
< br>到一起成为一个大片段。最后,应用无缝克隆试剂盒将该大片段插入
PL0007
质粒的特定位
点。
结果
经酶切鉴定和
DNA
测序证
明所构建的重组质粒完全正确,插入序列碱基无一突
变。
结论<
/p>
联合应用融合
PCR
< br>技术和无缝拼接技术可以高效的在质粒载体中连续无缝插入多
个片段,阳性率比传
统技术更高,操作更方便。
[
关键词
]
:重组质粒、融合
PCR
、无缝拼接
[
中图分类号
] R382.3+1
A highly efficient method
for the construction of recombinant plasmid
with several DNA fragments
insertion for knockout
Plasmodium
genome
[Abstarct]
Objective
In this study, we
describe a general method for plasmid assembly
that uses
infusion
method
to
insert
three
DNA
fragments
into
plasmid
PL0007.
Methods
At
first,
we
designed the fusion PCR primers, which
request 15bp overlap sequence between the primers,
and
the first insertion fragment of the
5' terminal and the last insertion fragment of the
3' terminal also
overlap 15bp with the
vector. Secondly, infusion fragments, amplified by
PCR and purified with
the Gel
Extraction Kit, were infused into a integrated
fragment with
the method of fusion PCR
technology and then inserted into the
target site in the plasmid PL0007 with the
Infusion Kit. At
last,
the
recombinant
plasmid
was
proved
entirely
correct
with
no
mutation
in
the
sequence
of
bases
by
restriction
enzyme
digestion
and
DNA
sequencing.
Results
Restriction
endonuclease
reactions
was
used
to
identify
the
recombinant
plasmid
and
followed
by
sequence
analysis.
All
recombinant
plasmid
are
right
and
without
a
mutation
point
in
the
inserted
fragment.
Conclusion
Combined with fusion PCR technology and
fusion PCR technology may insert
m
μl
tiple fragments
into plasmid vectors with high efficacy
and more convenient, and the positive rate is
higher than
the traditional technology.
[Key words]
recombinant
plasmid; infusion PCR reactions;
homologous recombination
随着基因测序技术的日益成熟,<
/p>
多种生物的全基因组测序已经完成,
功能基因组学已成
为时下研究的热点
[1]
。
构建重组质粒在细胞中插入某些基因使其表达及进行基因敲除是研究
基因功能的重要方
法
[2]
。然而传统的酶切连接的方法只对于质粒中单片段的插
入较为合适,
当涉及到要在质粒中连续插入多个片段时往往需要设计多个酶切位点,
p>
并且不可避免地在片
段与片段之间引入无关酶切位点,
这可能会影响插入片段的表达。
有时还会因找不到合适的
酶切位点而无法构建出目的重组质粒。
为了克服传统方法的缺陷出现了以聚合酶链反
应为基
1
础的实现多片段拼接的技术即融合
PCR
技术,
在质粒构建方面也出现了基于同源序列同源<
/p>
重组反应的无缝克隆技术。融合
PCR
技
术
[3-5]
在无需限制性内切酶和连接酶的情况下,通过
p>
具有同源互补序列的引物将各需要拼接的片段单独扩增出来,
同时以
两单独片段共同作为模
版,再加入首尾两端的引物再进行一轮
P
CR
即可将任意两片段实现无缝拼接。这种技术只
适用于构建一
些线性化的
DNA
片段,无法实现重组质粒的构建。无缝克隆技
术
[5,
6]
是指通
过在设计插入片段引物时在
5’
端引入载体上的一段同
源序列扩增出与载体有一定
(15bp)
同
源序列的插入片段,
进而通过重组酶的作用将插入片段无缝拼接入载体质粒中。
p>
理论上该方
法可以实现单片段和多片段拼接,
但在实际应用中发现单片段拼接时效率较高,
随着拼接片
段数
量的增加同源重组效率会大大降低,有时很难得到阳性结果。
鉴于目前多片段重组质粒构建普遍存在的问题,本研究对联合运用融合
PCR
技术和无
缝克隆技术构建多片段重组质粒的方法进行了探索。成功构建了三
片段同时插入
PL0007
质
粒的一种
基因敲除重组质粒。
并对多片段融合与无缝克隆的操作步骤、
反
应条件、
技术要点
进行了详细地论述。
与普通
PCR
反应相比,本实验的融合
PCR
反应改进了引物浓度,模版浓度,延伸时间
等条件。本实验以构建伯氏疟原虫基因敲除及替换重组质粒为例。在
PL00
07
质粒中插入敲
除序列
5’UTR<
/p>
和
3’UTR
,以及表达序列
mouseMAGE-A3
、
gfp-
3’pbdhfr/ts
。
(如图
1
)
1
、
材料与方法:
1
作者简介:刘权兴,硕士研究生,主要从事肺癌的基础和临床
研究。
通讯作者:戴纪刚,新桥医院胸外科副主任医师,
p>
E-mail:
691057831@
基金资助:国家自然科学基金面上项目
(
项目批准号
:81172238)
1.1
质粒与菌株
基因敲除所用的
PL0007
质粒、
PL0017
质粒由美国
NIH
苏新专教授惠赠,
DH5α
< br>感受态购自北京天根生化科技有限公司。
1.2
培养基
细
菌培养基
SOB
培养基、
2-YT
p>
培养基(见萨姆布鲁克主编分子克隆实验指南
第三版)
;细胞培养基
DMEM
、胎牛血清购自
Hyclone
公司。
1. 3
试剂
PCR
用的聚合酶
< br>KODFX
、
KODPlus
均
购自日本
TOYOBO
公司;无缝克隆试剂
盒
infusion
、反转录试剂盒、
Quickcut
限制性内切酶切酶
Bgl
Ⅱ
,
Pst
Ⅰ
,
Xho
Ⅰ,分子量标准
DL
2000
Marker
均购自日本
T
akara
公司;
RNA
提取试剂盒、
胶回收试剂盒、质粒提取试剂
盒购自美国
OMEGA
公司;
500bp DNA ladder
和
1Kb DNA ladder
均
购自北京天根生化科技
有限公司;胎牛血清购自美国
Hyclo
ne
公司。
1. 4
细胞与虫株
LLC
细胞系购自上海中科院细胞库,伯氏疟原虫
ANKA<
/p>
株(
Plasmodium
berghei
ANKA,
P
p>
.b
)由本实验室保存。
1.5
提取
LLC
< br>细胞培养及
cDNA
提取
首先,
用细胞培养瓶培养
LLC
细胞系,
培养液为含
10%
胎牛血清的
DMEM
培养基,
培养条件为
37
℃、
5%
的
CO
2
孵箱。待其
LLC
细胞铺满瓶
底后,常规胰酶消化。
p>
1000g
离心
5min
< br>,弃上清。运用
RNA
提取试剂盒提取
< br>LLC
细胞总
RNA
然后立即运
用反转录试剂盒将其转录为
cDNA
于
-20
℃保存。
1.6
伯氏疟原虫基因组提取
取疟原虫感染的昆明小鼠全血约
100
μl
,用
1 ml 1%
的
saponin / PBS
p>
于
37
℃
裂
解
红
细
胞
,
30min
后
加入
p>
400
μl
消化缓冲液,
2
μl
蛋
白酶
K (20 mg / ml)
至终浓度为
100
μg/ml
,
待蛋白消化完全后用酚
/
< br>氯仿
/
异戊醇法抽提基因
组
p>
DNA
。获得的基因组
DNA
于
-20
℃保存。
1.7
引物设计
根据不同的模版设计相应的引物,融合
PCR
主要用于拼接
5’UTR
、<
/p>
mouseMAGE-A3
和
3’pbd
hfr/ts
三个片段长度分别为
800bp,960bp
p>
及
1209bp
。所有引物由上
海英骏生物技术有限公司合成。
其中小写部分为相邻片段同源序列,
大写部分为引物特异性
结合序列
(
表一
)
。
表一
目的片段扩增所用引物
引物类型
FW
引物序列
tgattacgccaagctagatctGCATTAGCATAACATCTC
模板
P
.b
ANKA
基因组
目的片段
P.b
5’UTR
RV
FW
atgggaatcagccatCACTTTCATATATTTGTTATTTG
acaaatatatgaaagtgA
TGGCTGA
TTCCCATAACACC
LLC
细胞
cDNA
mouseMAGE-A3
RV
FW
RV
FW
cctttactcatggatccGAATGTGTGTAGGTCAGAGG <
/p>
gacctacacacattcGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC
agaattaagctgggctgcagGTTGAATTCGAGCTCGGTA
C
ttcgggtaccctcgagCATATGTTTGTGTAACATC
P
.b
ANKA
基因组
P.b
3’UTR
Pl0017
质粒
gfp-
3’pbdhfr/ts
RV
tatcgctagcctcgagTGTGCTTAAATGTTTCTTTAAAC
1.8
待融合片段的独立扩增
按常规
PCR
方法对个片段进行独立扩增,扩增使用酶为
KODFX
个片段
的扩增条件见(表二)
。扩增产物用
1%
的琼脂糖凝胶电泳检测,确定目的条
带。切胶,用
OMEGA
胶回收试剂盒回收。
表二
KOD
FX
扩增的反应条件
目的片段
P.b
5’UTR
mouse MAGE-A3
gfp-
3’pbdhfr/ts
P.b 3
’
UTR
引物用量
10pmol
10pmol
10pmol
10pmol
反应条件
35cycles(94
℃
20s;64
℃
30s;68
℃
50s)
35cycles(94
℃
20s;64
℃
30s;68
℃
60s)
35cy
cles(94
℃
20s;64
℃
p>
30s;68
℃
75s)
35cycles(94
℃
20s;64
℃
30s;68
℃
50s)
片段长度
800bp
960bp
1209bp
759bp
1.9
融合
PCR
反应
测定个片段胶回收产物的浓度,
PCR
反应体系使用
KODPlus
酶
(
高保
真性
)
在
25
μ
l<
/p>
融合
PCR
体系中加入需拼接的两片段各
50ng
,引物浓度降低到
2.5pm
ol/L
,反
应后得到两片段拼接产物,
以此产物进行胶回收将获得的融合片段再与第三个片段进行融合
PCR
反应,从而得到三片段拼接全长片段。具体反应条件见表三。
表三
融合
P
CR
反应条件
待融合的片段
P.b
5’UTR
mouse MAGE3
添加引物
P.b 5’UTR
FW
mouse MAGE-A3 RV
引物用量
2.5pmol
2.5pmol
2.5pmol
反应条件
35cycles(94<
/p>
℃
20s;64
℃
30s;68
℃
110s)
3
5cycles(94
℃
20s;64
℃
30s;68
℃
3min)
gfp-
3’pbdhfr/ts
RV
2.5pmol
融合产物
长度
P
.b
5’UTR
-mouse
1760bp
MAGE3
P
.b
5’UTR
-mouse
MAGE3
-gfp-
3’pbd
hfr/ts
2969bp
P.b
5’UTR
-mouse
P.b
5’UTR FW
MAGE3
gfp-
3’pbdhfr/ts
1.10
无缝克隆方法拼接及重组质粒的转化
在引物设计之初就已经在融合片段两端加入了
双酶切(
Bgl<
/p>
Ⅱ
/
Pst
Ⅰ)
后的线性化载体两端的
15bp
同源序列,基于同源重组的原理
,在
infusion
重组酶的作用下将上述融合片段连接到<
/p>
PL0007
载体中。反应
15min<
/p>
后将重组产物
常规转化大肠杆菌(
DH5
α
)
,
4000r/min
离心
3min
,去上清
8
00
μl
,
用枪头将菌液和剩余上清<
/p>
吸打混匀全部涂布在含氨苄青霉素
100
μ
g/ml
的
LB
平板上
,37
℃倒置培养
16
p>
小时候,挑菌、
2-YT
培养基摇菌。进行
菌落
PCR
初步鉴定。
1.11
重组质粒的鉴定
对菌落
PCR
获得的阳性菌液,
进行运用质粒抽提试剂盒进行质粒抽
提纯化
。
将获得的所有质粒进行酶切鉴定,
并进一步对插入片段进行测
序。
重组质粒一运用
Bgl
Ⅱ
/
pst
Ⅰ双酶切鉴定,重组质粒二分别运用<
/p>
Bgl
Ⅱ
/
Ps
t
Ⅰ双酶切和
Xho
Ⅰ
单酶切鉴定。插
入片段的测序由上海英骏生物技术有
限公司完成。
2
、
结果
2.1
成功获得待插入
DNA
片段
插入片段有三个独立的片段构成:
5’UTR
、
mouse MAGE3
和
gfp-
3’pbdhfr/ts
。片段长度
分
别为
800bp
、
960bp
、
1209bp
(如图
1a
)
。
其中
5’UTR
是疟原虫基因组中的一段序列、
mouse
MAGE3
为一段肿瘤特异性抗原基因、
gf
p-
3’pbdhfr/ts
为一段荧光蛋白基因及其终止序列
。
电泳分析结果表明两次融合
PCR
扩
增产物长度分别为
1760bp
和
29
69bp
,与预期结果相符
(如图
1b
、
1c
)
。产
物条带清晰,特异性强,无其他非特异性扩增。实验重复了三次均获得
目的片段。
(a)
(b)
(c)
(a)
M
:
DL2000 Marker
1
:
5’UTR
2
:
mouse MAGE3
3
:
p>
gfp-
3’pbdhfr/ts
(b)
M
:
500bp Marker
1
p>
:
5’UTR
2
:
mouse MAGE3
3
:
5’U
TR
与
mouse
MAGE3
两
片段融合产物
(c)
M
:
500bp Marker
1
:
p>
5’UTR
与
mouse MAGE3
段融合产物
2
:
gfp-
3’pbdhfr/ts
;
3
:
5’UTR
/m
ouse MAGE3
与
gfp-
3’
pbdhfr/ts
两片段融合产物
图
1
融合
P
CR
反应核酸电泳分析
2.2
重组质粒一的成功拼接
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