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双荧光素酶报告实验
实验名称：
双荧光素酶报告实验
实验基础知识：
荧光素酶
（英文名称：
Luciferase
）
是自然界中能
够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为
Pho
tinus pyralis
的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光
的产生是来自于萤光素的氧化，
有些情况下反应体系中也包括三磷酸<
/p>
腺苷
（
ATP
）
。
没有荧光素酶的情况下，
萤光素与氧
气反应的速率非常
慢，
而钙离子的存在常常可以进一步加速反应
（与肌肉收缩的情况相
似）
。
双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，
通常一个
报告基因作为内对照
,
使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表
达时双报告基因通常用来瞬时转染培养
细胞，
带有实验报告基因的载
体共转染带有不同的报告基因作为
对照的第二个载体。
通常实验报告
基因偶联到调控的启动子
,
研究调控基因的结构和生理基础。报告基
因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，
偶联
< br>到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照
,
使测试
不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法
,
可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性
,
比
如
,
培养
细胞的数目和活力的差别
,
细胞转染和裂解的效率。
理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具
有的速度
,
灵敏和线性范围对同一样品中的两个报
告基因同时测定。
这在传统的报告基因
,
如
CAT,
β
-Gal
和
GUS
是不可能的
,
由于它们
测试化学
,
处理要求所固
有的局限。相反
,
结合萤火虫
(
Photinus
pyralis )
和海洋腔肠
( Renilla
reniformis )
双荧光素酶的系统可满足
这些要求
，在单管中完成这些测试。
实验原理：
将目的基因
3
’
UTR
区域或者
lncRNA
序列构建至载体中报告基
因
Luciferase
的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞
中，通过
比较过表达或者干扰
miRNA
后，检测报告基因表达的改变（以萤火
虫荧光素酶为报告基因，
以海肾荧光素酶为内参基因）
可以定量反映
miRNA
对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定
miRNA<
/p>
与靶基因
3
’
U
TR
的作用位点。
从这两个图谱中可
以发现，
ppGL3-Basic
这个载体主要是用于评
估
miRNA
与靶基因
3
’
UTR
的结合，靶基因的
3
’
UTR
放在荧光
素
酶的后面，
这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，
而
pRL-TK
这个载体则
表
达海肾荧光素酶，
将这两个质粒共同转染进入
293
细胞中来检测荧
光时，
pRL-
TK
这个质粒起到一个内参的作用。
3
、
pmir-GLO
将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体
上，偏差更小且单质粒转染比
双质粒共转染更简单。该质粒也是由
promega
公司开发的
，图谱如下所示：萤光素酶是理想的报告基因，
因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶
，
一旦转录完成立刻就生成
功能性的萤光素酶，
同时在所有的化学发光反应中，
它的光产物具有
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