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让每个人平等地提升自我
转录组测序结题报告
篇一：转录组测序问题集锦
转录组测序问题集锦
转录组是某个物种或者特定细胞类
型产生的所有转录
本的集合，转录组测序
(RNA-seq)
是最近发展起来的利用深
度测序技术进行转录分析的方法
,
可以对全转录组进行系统
的研究。
Roche
GS FLX Titanium
、
Illumina
Solexa GA IIx
和
AB SOLID
4
均可以对转录组进行测序，
Roche GS FLX
Titanium
与
Illumina
Solexa GA IIx
和
AB SOLID 4
相比，
拥有更长的读长和较小的数据量，适用于表达量较高基因的
RNA
全长测序。但是对低表达丰度的基因，可能需要多次测
序才能得到足够的数据，成本比较高
，而
Illumina
Solexa
GA IIx
和
AB SOLID 4
数据读取量大，能够得到较高的覆盖
率，可以较好的降低成本。
若是位置基因组序列的物种，则
Roche GS FLX Titanium
测序更有优势，其较长的读长便于
拼接，获得更好的转录本数据。
转录组测序可
以供研究者在转录本结构研究（基因边界
鉴定、可变剪切研究等）
，转录本变异研究（如基因融合、
编码区
SNP
研究）
，非编码区域功能研究（
Non-
coding RNA
1
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研究、
miRNA
前体研究等）
，
基因表达水平研究以及全新转录
本发现等方面进行深入研究。
< br>
研究转录组的方法有哪些？
目前研究转录组的方法主要三种，
基
于杂交技术的
cDNA
芯片和寡聚核苷酸芯片，
基于
sanger
测序法的
S
AGE
(serial
analysis
of
gene
expressio
n)
、
LongSAGE
和
MPSS(massively parallel signature sequencing )
，基于
第二代测序技术的转录组测序，又称为
RNA-Seq
。
转录组测序比其他研究方法有哪些优势
?
（
1
）可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分
辨率的准确度，同
时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号
带来的交叉反应和背景噪音问题；
（
< br>2
）灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有
转录
本；
（
3
）可以对任意物种进行全基因组分析，无需预先设
计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任
何物种进行转录
组分析，同时能够检测未知基因，发现新的
转录本，并准确地识别可变剪切位点及
cSNP
，
UTR
区
域。
（
4
）检测范围广，高于
6
个数量级的动态检测范围，
能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。<
/p>
2
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转录组测序有什么样的样品要求？
（
1
）
样品纯度要求：
OD
值应在
1.8
至
2.2
之间；
电
泳检测
28S:18S
至少大于
1.8
。
（
2
）样品
浓度：
total
RNA
浓度不低于
400
ng/
μ
g
。
（
3
）
total
RNA
样品请置于
-20
℃保存；
请提供
total
RNA
样品具体浓度、体
积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请
同时附上
QC
数据，包括电泳胶图、分光光度或
Nanodrop
仪
器检测数据。
（
4
）样品
请置于
1.5 ml
管中，管上注明样品名称、浓
度以及制备时间，管口使用
Parafilm
封口。
建议使用干冰
运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样
品降解的可能性。
mRNA
的纯化分离方法？
进行
mR
NA
研究中，首先需要对样本进行总
RNA
抽提，
抽提得到的
RNA
除含有<
/p>
mRNA
外，
还含有
rRNA
和
tRNA
，
为防
止这两类
RNA
对转
录组研究的影响，因此我们需要对
mRNA
进行分离纯化。真核
细胞的
mRNA
分子最显著的结构特征是
具有
5
’端帽子结构（
m7G
）和
3
’端的
Pol
y(A)
尾巴。绝大
多数哺乳类动物细胞
mRNA
的
3
’
端存在
20-30
个腺苷酸组成
3
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的
Poly
（
A
）尾，通
常用
Poly
（
A+
< br>）表示。这种结构为真核
mRNA
的提取，提供了极为方
便的选择性标志，寡聚（
dT
）纤
维素
或寡聚（
U
）琼脂糖亲合层析分离纯化
mRNA
的理论基础
就在于此。
mR
NA
的分离方法较多，其中以寡聚（
dT
）
-
纤维
素柱层析法最为有效，已成
为常规方法。此法利用
mRNA 3
’
末端含有
Poly
（
A+
）的特点，在
RNA
流经寡聚（
dT
）纤维素
柱时，在高盐缓冲液的作用下，
mRNA
被特异地结合在柱上，
当逐渐降低盐的浓度
时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，
mRNA
被洗脱，经过两次
寡聚（
dT
）纤维柱后，即可得到较高
纯度的
mRNA
。
使用
So
lexa
进行转录组测序时，样本
RNA
如何进行片
段化处理？
cDNA
插入片段长度的选择？
Solexa
转录组测序文库构建时
采用专用的打断
Buffer
对
RNA
样本进行片段化处理，这种方法充分利用
RNA
对二价
阳离子的敏感性，具有稳定性好的优点，通过这种方法打断
能得到更加均匀的覆盖率。
mRNA-seq
可以既
可以采用单端测
序（
single
read
）
还可以采用双端测序（
paired end
）
，
对于单端测序来说片段长度
150-200bp
是理想的长度范围，
对于双端测序来说片
段长度推荐
300-500bp
，由于两端加入
了
Solexa
的锚定序列和引物序列，样品准备完成
后所获得
的产物长度比插入的
cDNA
长度要长。
4
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文库准备过程中，反转录引物的选择？
在进行
c
DNA
合成过程中，
经常用到的有两种引物：
< br>oligo
dT
引物和随机引物。
在
RNA
反转录过程中使用
oligo dT
引
物进行扩增可以
保证扩增产物包括
mRNA
的
3'
末端，
减少
rRNA
的干扰，
但是
采用<
/p>
oligo dT
引物扩增有一个问题，就是扩增片段的长度<
/p>
偏短和扩增产物所包含的信息量偏向
3
’
端的问题，之所以
有长度偏短，一方面与
RNA
完整性有关，但最重要的限制在
于逆转录酶的延伸能力。
用
oligo dT
引物扩增出来的片段长度短，虽然都有
mRNA
的
3'
端
，但是序列信息多位于
3'-UTR
附近，若扩增序列太
短，则有用信息很少，不利于序列的识别和分析。
使用
Random
primer
扩增，虽然扩增偏短长度也很短，
但是由于它的逆转录并不一定在
mRNA
的末端起始
，而是在
随机位置起始，所以它的扩增片段带有更多
CDS
的信息，但
是如果是用总
RNA
逆转录的话，
有可能会受到
rRNA
的干扰。
采用
Sole
xa
进行转录组测序，测序文库准备过程中，由于
实验之前已经
采用
oligo dT
微磁珠进行纯化，而且
< br>mRNA
已
经进行了片段化处理后才进行反转录，因此反
转录只能采用
随机引物进行
cDNA
的
合成，如果采用
oligo dT
进行扩增，
< br>只能得到
mRNA
的
3'
端序列，无法得到完整的
mRNA
序列。
5
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Solexa
进行转录组测序，
测序文库的制备方法及质控标
准？
首先会样本进行质量检测，检测合
格后，对样本进行测
序前处理，构建测序文库，构建步骤为：
（
1
）首先利用
oligo dT
微珠纯化
mRNA
；
（
2
）将纯
化得到的
mRNA
进行片段化处理；
（
3
）利用逆转录酶反转录合成
cDNA
第一链
；
（<
/p>
4
）以
cDNA
第一链为模板合成双链
cDNA
；
（
5
）对双链
cDNA
进行末端修复并在
3
’末端加’
A
”<
/p>
；
（
6
）在
DNA
片段的两端连接上特定的测序接头；
（
7
）
割胶纯化连接好的
cDNA
片段
（一般回收
200-500bp
之间的片段）
；
（
8
）利用高保真聚合酶扩增测序文库；
（
9
）检测测序文库。对于测序文库，需要进行质量控
制，一般通过
Aligent
Technologies
2100
分析仪和电泳观
察两种方法检
测测序文库的大小，纯度及浓度。
转录组测
序结果的影响因素？
RNA
的
降解严重影响测序的质量，
RNA
降解后，加入
6
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poly-
A
后无法捕获纯化
mRNA
，因此，随
机引物反转录无法
得到全部的
cDNA
，导致测序结果出现明显的
3
‘
-
和
5
’
-
偏
向。
文库中的
pol
y-A
多聚物的存在会对测序信号产生干扰，
影响测序结果的准
确性；同时由于转录组中转录本的丰度不
一致，实验前需要对样本进行均一化处理，否则
高丰度的表
达基因会掩盖低丰度表达基因，导致寻找新基因失败或者是
< br>获得大量无意义的重复序列。
转录组测序需要多大的测序量才能得到有意义的结
果？
转录组测序前，需要对物种转录组的大小进行评估，评
估方法如下：
（
1
）对于有
reference genome
的物种，可以分析基因
组信息，统计编码基因的个数，及其碱基数，
从而估计物种
转录组的大小，另外可以查询相关或相近物种转录组研究的
文献，作为参考。
（
2
）对于无
re
ference genome
的物种则只能参考相近
物种的转
录组大小。
由于转录组需要进行表达量的分析，因此在转录组测序
中不推荐覆盖度，在进行不同
基因和不同实验间的基因表达
差异分析时，人们提出了
RPM<
/p>
和
RPKM
的概念。
RPM
（
Reads
7
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让每个人平等地提升自我
Per
Million
reads
）
即每百万
reads
中来自于某基因的
reads
数，考虑了测序深度对读段计数的影响。
< br>RPKM
（
Reads Per
Kilo bases per Million reads
）是每百万
reads
中来自于
某基因
每千碱基长度的
reads
数。因此，在确定转录组的测
序量时，最好以产生的读长数目做依据，参照转录组大小，
估计需要的
读长数目，来确定转录组需要的测序量。
如何处理转录组测序中存在的系统噪音和偏差？
虽然深度测序技术的准确性较以前
的技术有了很大提
高，但仍然存在错误和噪声。比如内含子区内有一些不连续
的
reads
，很可能由系统噪声造成，如样品污
染、测序错误
和不恰当的
read
定位
策略等。另外，外显子区域内的
read
信号分布有时也很不均
匀。
有文献报道，
序列组成尤其是
GC
含量、
RNA
二级结构等也有可能是导
致
read
不均匀分布的原
因。这些噪
声和分布偏好将影响新基因的识别和对剪接异构
体形式和表达水平推断。
合理地建模
RNA-seq
数据中的系
统噪声和偏好是解决上
述问题最有效的办法。基本的思路可以是：首先根据实验原
理寻找可能产生系统噪音或偏差的因素，并尽可能将这些因
素转化成可
量化的特征，如序列特征、二级结构等；然后，
将用实验数据对这些特征做统计分析，构
造和训练模型，用
模型来对数据进行校正。需要注意的是，某些偏好是由当前
8
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让每个人平等地提升自我
的测序技术
和分析方法共同造成的，难以完全消除。在这种
情况下，后续处理和解释时需要充分意识
到这种偏好可能对
生物学结论带来的影响，必要时通过补充其他实验来验证和
修正通过高通量测序得到的生物结论。
葛博
XX
年
05
月
篇二：转录组测序
转录组分析
研究背景：
RNA-Seq
是通过结合实验和计
算方法来鉴定生物样品中
RNA
序列的种类和丰度的一种技术。
通过
RNA-seq
，我们就
能够确定
单链
RNA
分子中
ATCG
的顺序。
整个过程主要包括：
从细胞或组织中提取
RNA
分子、文库的构建以及后继的生物
信息学数据分析。
RNA-Seq
技术具有许多早期研究方法
（如：
微阵列）所不具备的优点，如：
RNA-Seq
平台的高通量、新
技术所带来的高灵敏度、发现
新转录本、新基因模型以及非
编码
RNA
的能力等。
RNA-Seq
技术的到来，使人们认识到，无论是单细胞模<
/p>
式生物还是人类，我们对其转录组的认知异常匮乏。而
RNA-
Seq
产生的新的数据，则可以帮助我们发现基因结构上
9
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让每个人平等地提升自我
的
巨
大
差
异
、
鉴
定
出
< br>新
的
转
录
本
以
及
能
够
对
small
non-coding
RNA
和
lncRNAs
有着更好的了解。而且随着测序
花费的降低，
RNA
-Seq
的优势体现的更加明显。
服务流程：
样品选取
mRNA
片段化
cDNA
合成
末端修复、
加
polyA
、
加接头，
PCR
扩增
数据分析
测序方案：
内容：
T
otalRNA
检测，
普通转录组文库构建及测序及信
息分析。
测序方式：
HiseqPE125
。
项目周期：有参
45
天，无参
50
天。
分析内容：
无参考基因组：
1.1
质量控制
1.11
评估碱基质量
1.12
过滤低质量
reads
1.13
去掉低质量碱基和接头序列
10