-
miRNA
研究方法
尽管早在
1993
年,科学家就发现了第一个
< br>microRNA
,但直到
2003
年以后,这种小
RNA
分子的大
作
用才不断被发现。研究显示:
miRNA
通过与转录本的相互作
用,关闭或抑制基因的表达,影响了
30%
的
< br>基因。
miRNA
在多个组织中,例如正常和肿瘤组织中
差异表达。因此,通过表达谱分析寻找疾病相关
miRN
A
p>
并进行发病机理研究,最终应用于肿瘤诊断和治疗,已经成为目前
m
iRNA
研究的重要方向。在研究中,从
深度测序、
miRNA
芯片到通过导入化学合成的
mimic
s/antagomirs
等实现
miRNA
< br>过表达和抑制,都是研
究中常用的方法。同时,在
miR
NA
研究中,生物信息学分析扮演着越来越重要的角色。
p>
下表介绍了
miRNA
研究和应用中科学家
关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。
目
的
m
p>
有哪些
miRNA
表达?
< br>
iRNA
表达情
况
生物信息学分析预测可能的
mi
RNA
,进一步验证
问题
研究方法
应用
深度测序
&
生物信息学分析
发现新的候选
miRNA
miRNA
何时表
达?在哪里表达?表
达差异?<
/p>
m
iRNA
表
达特
征
miRNA
< br>芯片,磁珠流式细胞
m
iRNA
表达谱
qPCR
对
hit
< br>miRNA
进行验证,
Northern
Blot
,原位杂交等
生物信息学分析
qPCR
对
hit
mRNA
进行验证,
Western
Blot
等方法检测蛋白表达
发现差异
miRNA
,
为进
一步功能研究、诊断,预后判
断,疗效检测等奠定基础
<
/p>
miRNA
控制哪
些基因?这些基因功<
/p>
能?所在信号通路?
m
iRNA
功能分
析
水平
转入
miRNA
mimics
观察相应
mRNA&
蛋白水平变化以及相关现
象
(
miRNA
低表达情况)
转入
miRNA
a
ntagomirs
观
察相应
mRNA
&
蛋白水平变化以及相
关现象(
miR
NA
低表达情况)
生物信息学分析<
/p>
miRNA
结合靶
机理研究,功能研究<
/p>
miRNA
如何控
制靶
miRNA
确
定结合
位点
mRNA
3
ˊ
UTR
的可能序列
构建包含
miRNA
结合位点(
3
ˊ
UTR
)
以及位点突变的萤光素
酶报告
载体进行验证
机理研究
miRNA
功能
(与特定疾病、
表型的
m
iRNA
功能分
细胞水平:过表达及抑
制实验
(见前)
,
观察表型及现象变化
以及上
功能研究
关系)
析
下游通路变化
动物模型:过表达及抑
制实验
(见前)
,
观察表型及现象变化
以及上
下游通路变化
临床组织样本,
检测
miRNA
表
达情况与疾病相关性
选择疾病相关的一个或一组
mi
RNA
,或结合其它基因水平变化,进
p>
行
q-RCR
等检测
转入合成的小分子
miRNA
模拟
物
(
miRNA
低表达情况)
或拮抗剂
(
m
iRNAG
高表达情况)
治疗
检测
miRNA
应用于
诊断
断
诊
诊断,
预后判断,疗效
miRNA
应用于
治疗
疗
治
p>
miRNA
主要研究技术
深度测序
抽提分离小分子(例如
p>
18-30nt
)
RNA
< br>,通过
RT-PCR
扩增之后,利用
solexa
深度测序,
并进行生物信息学分析,
获得
miRNA
表达谱。
深度测序结合生物信息学分析手段,
可以对海量数据进行分析,
分别统计出已知的
miRNA
(
mi
RNA-known
)、新的
miRNA
(
miRNA-new
)以及可能的新
miRNA
(
mi
RNA-
cadidate
new
),并对新发现的
< br>miRNA
进行靶基因分析,功能预测等。通过深度测序的方法,可以
发现新的
miRNA
,为进一步的深入研究奠定基
础。
miRNA
芯片
利用
miRNA
芯片(例如
Agi
lent
miRNA
芯片),可以高通量分析
miRNA
表达的时
空特异性、不同样本(例如癌组织
和癌旁组织)中
miRNA
的差异表达,进而进行把基因分析,
功能注释、通
路分析,网络分析等,以了解
miRNA
在疾病发生中的作用。与深度测序不同,
miRNA
芯片针对已知
miRN
A
进行研究
。筛选到的差异
miRNA
可以利用
q
-pCR
进行验证。
q-PCR
q-PCR
技术可以用来检测
miRNA
以及其靶
mRNA
和相关
mRNA
等
的检测,主要方法有茎
环法和加尾法等。前者针对特定
miRN
A
设计引物,特异性好,然而成本较高,周期长;后者采用通用引物,
< br>时间短,通量较大。
(
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)
Mimics
以及
Antogomirs
通常基因功能研究常常采用过表达或干涉(抑制、敲除)等方法,
mi
RNA
研究也不例外。
通过导入化学合成的小分子
miRNA
mimics
或拮抗
miRNA
p>
的
antagomir
,
< br>观察靶
mRNA
及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表
型变化,进行信号通路研究,是目前
miRNA
功能研究的常用
方法。
萤光素酶报告系统
在确定了靶
mRNA
之后,找到位于
3
ˊ
-UTR
区的
miRNA
结合位点是研究者下一
步关心的内
容。通过生物信息学分析获得候选的
miRNA
结合区域,将野
生型和结合位点突变的
3
ˊ
-UTR<
/p>
序
列克隆入商品化的萤光素酶报告载体(例如
pMIR-REPORT?
miRNA
Expression
Reporter
< br>Vector
系
统),通过观察
miRNA
对发光强度的影响对结合位点加以验证。
miRNA
的研究方法还有很多,例如磁珠流式细胞仪分析
miRNA
表达谱,
Northern
Blot
或核酸原位
杂交检测
miRNA
的表达,
miRNA
克
隆、测序等等。另外,在
miRNA
研究中,随着高通量测序、
芯片的技
术不断发展,另一个重要的工具
--
< br>生物信息学分析发挥着越来越重要的作用。
miRNA
研究中常用的软件和数据库资源
以下
是常用的
microRNA
靶标数据库和软件资源列表,希望对
microRNA
的研究者有所帮助。
(
1
)
p>
miRbase
:
众所周知的
microRNA
基因注释数据库。
目前
miRBase
只提供了
microRNA
的靶
标的预测软件的链接(如:
PicTar
)。
网址:
/
(
2
)
p>
starBase
:一个高通量实验数据
C
LIP-Seq
(或称为
HITS-CLIP
< br>)和
mRNA
降解组测序数据
支
持的
microRNA
靶标数据库,整合和构建多个流行的靶标
预测软件的交集和调控关系。网址:
http://sta
/
(
3
)
p>
Tarbase
:一个收集已被实验验证的
microRNA
靶标数据库。网址:
/tar
base/
(
4
)
p>
miRecords
:一个整合的
micr
oRNA
靶标数据库。整合多个靶标预测软件的调控关系。网址:
/
(
5
)
targetScan:
基于靶
mR
NA
序列的进化保守等特征搜寻动物的
microRNA
靶基因。是预测
m
icroRNA
靶标假阳性率较低的软件。而且是
microRNA
领域大牛
Bartel
实验室开发的。网址:
http://ww
/
(
6
)
p>
PicTar
:基于
microRNA
p>
或
microRNA
靶标联合作用等特征开
发的搜寻动物的
microRNA
靶
基
因的软件,假阳性率也较低。是
microRNA
领域大牛
p>
Rajewsky
实验室开发的。该文章位列
miRNA
相关
文章引用
Top5<
/p>
。网址:
/
(
7
)
p>
PITA
:基于靶位点的可接性(
targ
et-site
accessibility
)和自由能预测
microRNA
的靶标。
是著名的生
物信息学家
Segal
实验室开发的。网址:
< br>/pubs/mir07/mir07_
(
8
)
p>
RNA22
:基于序列特征预测
micro
RNA
的结合位点。是几个流行的
microRNA
靶标预测软件
的其中一个。
IBM
公司的研究团队开发的。网址:
/
(
9
)
p>
miRanda
和
:是著名的
Memorial
Sloan-
Kettering
癌症研究中心的研究人
员开发的软件和数
据库。
miRanda
的最新版本又叫
mirSVR
。网址:
/microrn
a/
(
10
)
MicroCosm
:
EMBL-
EBI
的
Enright
实验室开发
的
microRNA
靶标数据库。网址:
http://
/enright-
srv/microcosm/htdocs/targets/v5/
(
11
)
<
/p>
miRTarBase
:整合实验证实的
microRNA
靶标的数据库。网址:
.
/
(
12
)
miRGator
v2.0
:整合<
/p>
microRNA
表达、靶标和疾病相关信息的数据库。网址:<
/p>
http://mir
:8080/MEXWebApp/
(
13
)
<
/p>
MiRNAMap:
动物的
microR
NA
基因及其靶标的数据库。网址:
/
(
14
)
miRDB:
动物
microRNA
靶标预测和功能注释数据库。网址:
/miRDB/
(
15
)
<
/p>
RNAhybrid
:一个基于
miRN
A-target
配对自由能预测
microRNA
的靶标的软件。网址:
ht
tp:///rnah
ybrid/
(
16
)
<
/p>
miRGen
:
microRNA
基因和
microRNA
靶标数据库。网址:
/
-
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