-
V5-tag
5
ˊ
GGT AAG CCT ATC
CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG
3
ˊ
G
K
P
I
P
N
P
L
L
G
L
D
S
T
6 X His tag
CAT CAT CAC CAT CAC CAT
H
H
H
H
H
H
S-tag
AAA
GAA
ACC
GCT
GCT
GCT
AAA
TTC
GAA
CGC CAG CAC A TG GAC A
GC
KETAAAKFERQHMDS
Flag-Tag GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT
AAG
D
Y
K
D
D
D
D
K
Myc-Tag
GAG CAG AAA CTC ATC TCT GAA GAG GAT CTG
E
Q
K
L
I
S
E
E
D
L
HA-
Tag
TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT
Y
P
Y
D
V
P
D
Y
A
VSV-G:
TATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG
Thrombin recognises the
consensus sequence Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser
Sequence
：
CTG GTT
CCG CGT GGA TCC
重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体
领域。
特别是体内功能研究和蛋白质的
大规模生产都需要应用重
组蛋白表达载体。
美国
GeneCo
poeia
的蛋白表达载体按照表达宿主的不同新推出
3
类，分别为表达宿主为
大肠杆菌，哺乳动物细胞的，以及慢病毒载体，
宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。
除了必要的复制和筛选
的元件，
协助表达和翻译的元件外，
本文将各类载体分别按照功
能标
签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下：
His6
：
His6
是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的
C
末端或
N
末端。当某
一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）
利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析
(IMAC)
，对重组蛋白进行分离纯化。
使用
His-
tag
有下面优点：
1.
标签的分子量小，
只有
~0.84KD
，而
GST
和蛋白
A
分别为
~26KD
和
~30KD
，
一般
不影响目标蛋白的
功能；
标签融合蛋白可以在非离子型
表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，
前者在纯
化疏水性
强的蛋白得到应用，
后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，
用高浓
度的变性剂溶解后
通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，
使复性不
受其它蛋白的干扰，
或进行金属螯和亲和层析
复性；
标签融合蛋白也被用于蛋白质
< br>-
蛋白质、蛋白质
-DNA
相互
作用研究；
标签免疫原性相对较低，
可将纯化的蛋白直接注射动
物进行免疫制备
抗体
；
5.
可应用于多种表达系
统，纯化的条件温和；
6.
可以和其
它的亲和标签一起构建双亲和标签。
Flag:
Flag
标签蛋白为编码
8
个氨基酸的亲水性多肽
（
DYKDDDDK
）
，<
/p>
同时载体中构建的
Kozak
序列使得带
有
FLAG
的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
FLAG
作为标签蛋白，其融合表达目的蛋
白后具有以下优点：
作为融合表达标
签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白
的功能、性质，这样就有
利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。
2.
融合
FLAG
的目的蛋白，可以直接通过
FLAG
进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可
以
纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。
< br>作为标签蛋白，其可以被抗
FLAG
的抗体识别，这样就
方便通过
Western Blot
、
ELISA
等方法对含有
FLAG
的融
合蛋白进行检测、鉴定。
4.
融合在
N
端的
FLAG
，其可以被肠激酶切除（
DDDK
），从而得到特异的目的蛋
白。因
此现
FLAG
标签已广泛的应用
于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相
关领域。
MBP:
MBP
（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为
40kDa
，由
大肠杆菌
K12
的
malE
基因编码。
MBP
可增加在细菌中过量表达的融合
蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。
MBP
标签可通过
免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，< p>
MBP
可以融合在蛋白的
N
端或
C
端。
纯化：
融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。
结合的融
合蛋白可用
10mM
麦芽糖在
生理缓冲
液中进行洗脱。
结合亲和力在微摩尔范围。
一些融合蛋白在
0.2% Triton
X-100
或
0.25%
Tween
20
存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。
缓冲条件为
pH7.0
到
8.5
，盐浓度可高达
1M
，但不能使用变性剂。如果要去除
MBP
融
合部分，可
用位点特异性蛋白酶切除。
检测：可用
MBP
抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。<
/p>
GST:
GST(
谷胱甘肽巯基转移酶
)
标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它
的天然
大小为
26KD
。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个
是因为它是一个高度
可溶的蛋白，
希望可以利用它增加外源蛋白
的可溶性；
另一个是它可以在大肠杆菌中大量表
达，起到提高表
达量的作用。
GST
融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表
达，可以在
大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用
10mM
还原型
谷胱甘肽洗脱。在大多数
情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。
GST
标
签
可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。
标签有助于保护重组
蛋白免受胞外蛋白酶的降解并
提高其稳定性。在大多数情况下
G
ST
融合蛋白是完全或部分可溶的。
纯化：该表达系统表达的
GST
标签蛋白可直接从细菌裂解液中
利用含有还原型谷胱甘肽琼
脂糖凝胶
(Glutathione
sepharose)
亲和树脂进行纯化。
GST
标签蛋白可在温和、
非变性条
件下洗脱，因此保留了
蛋白的抗原性和生物活性。
GST
在变性条件下会失去对谷胱甘
肽树
脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。
如果要去除
GST
融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。
检测：可用
GST
抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。
HA