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常用的几种蛋白标签

作者:高考题库网
来源:https://www.bjmy2z.cn/gaokao
2021-02-27 21:36
tags:

-

2021年2月27日发(作者:platinum)


重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。


特别是体内功 能研究


和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。



美国


GeneCopoeia


的蛋白表 达载体按照表达宿主的不同新推出


3


类,


分别为表达


宿主为大肠杆菌,


哺乳动物细胞的,


以及慢病毒载体,


宿主可以为哺乳动物细胞


和原代细 胞。



除了必要的复制和筛选的元件,


协助表达和翻译的元件外,


本文将各类载体分别


按照功能标签的 不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下:



His6




His6


是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的

C


末端或


N


端。


当某一个标签的使用,


一是能构成表位利于纯化和检测 ;


二是构成独特的结


构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基 侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可


用于固定化金属螯合层析


( IMAC)


,对重组蛋白进行分离纯化。



使用


His- tag


有下面优点:



1.

< p>
标签的分子量小,


只有


~0.84KD

< p>
,而


GST


和蛋白


A


分别为


~26KD



~30KD



一般


不影响目标蛋白的 功能;




标签融合蛋白可以在非离子型 表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯


化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者 在纯化包涵体蛋白时特别有用,


用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋 白,


使复性不受其它蛋


白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性 ;




标签融合蛋白也被用于蛋白质


-


蛋白质、蛋白质


-DNA


相互作用研究;




标签免疫原 性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动


物进行免疫制备






5.


可应用于多种表达系统,纯化的条件温和;



6.


可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。




Flag:



Flag


标签蛋白为编码


8


个氨基酸 的亲水性多肽(


DYKDDDDK


),同时载体中构建



Kozak


序列使得带有

FLAG


的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。


< /p>


FLAG


作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:< /p>




作为融合表达标签,其通常不会与目的 蛋白相互作用并且通常不会影响


目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋 白进行下游研究。



2.


融合


FLAG


的目的蛋白,


可以直接通过

< p>
FLAG


进行亲和层析,


此层析为非变性纯


化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高。




作为标签蛋白,其可以被抗


FLAG

< br>的抗体识别,这样就方便通过


Western


Blot



ELISA


等方法对含有

< p>
FLAG


的融合蛋白进行检测、鉴定。



4.


融合在


N


端的


FLAG


,其可以被肠激酶切除(


DDDK


),从而得到特异的目的蛋


白。因此现


FLAG


标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋

< br>白相互作用等相关领域。



MBP:



MBP

(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为


40kDa


,由大肠杆 菌


K12



malE

< br>基因编


码。


MBP


可增加在细菌 中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。


MBP


标签 可通过免疫分析很方便地检测。


有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。

< br>如果


蛋白在细菌中表达,


MBP


可以融合在蛋白的


N


端或


C

< p>
端。



纯化:融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一 步纯化。结合的融合蛋白可用


10mM


麦芽糖在生理缓冲液中进 行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在


0.2% Triton X-100



0.25% Tween 20

< br>存在下不能有效结合,而其他融合蛋白


则不受影响。


< /p>


缓冲条件为


pH7.0



8.5



盐浓度可高达


1M< /p>



但不能使用变性剂。


如果要去除


MBP


融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。



检测:可用


MBP


抗体或表达的目 的蛋白特异性抗体检测。




GST:



GST(


谷胱甘肽巯基转移酶


)


标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的


转移酶,它的天然 大小为


26KD


。将它应用在原核表达的原因大致有两个,一个


是因为它是一个高度可溶的蛋白,


希望可以利用它增加外源蛋白 的可溶性;


另一


个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表 达量的作用。


GST


融合表达系统


广泛 应用于各种融合蛋白的表达,可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。


结合的融合蛋 白在非变性条件下用


10mM


还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数 情况


下,融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二体。


GST< /p>


标签可用酶学分析或免疫


分析很方便的检测。

标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳


定性。在大多数情况下< /p>


GST


融合蛋白是完全或部分可溶的。



纯化:


该表达系统表达的


GST


标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷


胱甘肽琼脂糖凝胶< /p>


(Glutathionesepharose)


亲和树脂进行纯 化。


GST


标签蛋白可


在温和、非变性 条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。


GST


在变 性


条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,


因此不能在纯化缓 冲液中加入强变性


剂如:盐酸胍或尿素等。


< br>如果要去除


GST


融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除 。



检测:可用


GST


抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。




HA



HA


标 签蛋白,


标签序列


YPYDVPDYA



源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定


簇,


9


个氨基酸,对外源靶蛋白的空间结构影响小


, < /p>


容易构建成标签蛋白融合到


N


端或者


C


端。易于用


Anti


HA


抗体检测和


ELISA


检测。




c-Myc



C-Myc





< br>,






11








标< /p>








Glu-Gln-Lys-Leu- Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu




11


个氨基酸作为抗原表位表达


< p>
















抗< /p>




C-Myc


tag









Western- blot


杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中


,


可用于检测重组蛋白


质在靶细胞中的表达。




eGFP/eCFP/eYFP/mCherry


分别是增强型绿色荧光蛋白


/


增强型黄绿色荧光 蛋白


/


增强型黄绿色荧光蛋白


/



体红色荧光蛋白


,


具有不同的激发波长发射波长为,均由野生型荧光蛋白通过氨


基酸突变和密码子优化而来 。就


eGFP


而言,相对于


GFP


,其荧光强度更强、荧


光性质更稳定。同时载体中构建的

< p>
Kozak


序列使得含有


eGFP


的融合蛋白在真核


表达系统中表达效率更高。


mChe rry


是从


DsRed


演化来的性能最 好的一个单体红


色荧光蛋白,可以和


GFP

系列荧光蛋白共用,实现多色标记体内、外实验表明,


mCherry



N


端和


C


端融合外源蛋白时,


荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能

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本文更新与2021-02-27 21:36,由作者提供,不代表本网站立场,转载请注明出处:https://www.bjmy2z.cn/gaokao/676199.html

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