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重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。
特别是体内功
能研究
和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。
美国
GeneCopoeia
的蛋白表
达载体按照表达宿主的不同新推出
3
类,
分别为表达
宿主为大肠杆菌,
哺乳动物细胞的,
以及慢病毒载体,
宿主可以为哺乳动物细胞
和原代细
胞。
除了必要的复制和筛选的元件,
协助表达和翻译的元件外,
本文将各类载体分别
按照功能标签的
不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下:
His6
:
His6
是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的
C
末端或
N
末
端。
当某一个标签的使用,
一是能构成表位利于纯化和检测
;
二是构成独特的结
构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基
侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可
用于固定化金属螯合层析
(
IMAC)
,对重组蛋白进行分离纯化。
使用
His-
tag
有下面优点:
1.
标签的分子量小,
只有
~0.84KD
,而
GST
和蛋白
A
p>
分别为
~26KD
和
~30KD
,
一般
不影响目标蛋白的
功能;
标签融合蛋白可以在非离子型
表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯
化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者
在纯化包涵体蛋白时特别有用,
用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋
白,
使复性不受其它蛋
白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性
;
标签融合蛋白也被用于蛋白质
p>
-
蛋白质、蛋白质
-DNA
相互作用研究;
标签免疫原
性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动
物进行免疫制备
抗
p>
体
;
5.
可应用于多种表达系统,纯化的条件温和;
6.
可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。
Flag:
Flag
标签蛋白为编码
8
个氨基酸
的亲水性多肽(
DYKDDDDK
),同时载体中构建
的
Kozak
序列使得带有
FLAG
的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
<
/p>
FLAG
作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:<
/p>
作为融合表达标签,其通常不会与目的
蛋白相互作用并且通常不会影响
目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋
白进行下游研究。
2.
融合
FLAG
的目的蛋白,
可以直接通过
FLAG
进行亲和层析,
此层析为非变性纯
化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高。
作为标签蛋白,其可以被抗
FLAG
< br>的抗体识别,这样就方便通过
Western
Blot
、
ELISA
等方法对含有
FLAG
的融合蛋白进行检测、鉴定。
4.
融合在
N
端的
p>
FLAG
,其可以被肠激酶切除(
DDDK
),从而得到特异的目的蛋
白。因此现
FLAG
标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋
< br>白相互作用等相关领域。
MBP:
MBP
(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为
40kDa
,由大肠杆
菌
K12
的
malE
< br>基因编
码。
MBP
可增加在细菌
中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。
MBP
标签
可通过免疫分析很方便地检测。
有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。
< br>如果
蛋白在细菌中表达,
MBP
可以融合在蛋白的
N
端或
C
端。
纯化:融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一
步纯化。结合的融合蛋白可用
10mM
麦芽糖在生理缓冲液中进
行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在
0.2% Triton
X-100
或
0.25% Tween 20
< br>存在下不能有效结合,而其他融合蛋白
则不受影响。
<
/p>
缓冲条件为
pH7.0
到
8.5
,
盐浓度可高达
1M<
/p>
,
但不能使用变性剂。
如果要去除
MBP
融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。
检测:可用
MBP
抗体或表达的目
的蛋白特异性抗体检测。
GST:
GST(
谷胱甘肽巯基转移酶
)
p>
标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的
转移酶,它的天然
大小为
26KD
。将它应用在原核表达的原因大致有两个,一个
是因为它是一个高度可溶的蛋白,
希望可以利用它增加外源蛋白
的可溶性;
另一
个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表
达量的作用。
GST
融合表达系统
广泛
应用于各种融合蛋白的表达,可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。
结合的融合蛋
白在非变性条件下用
10mM
还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数
情况
下,融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二体。
GST<
/p>
标签可用酶学分析或免疫
分析很方便的检测。
标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳
定性。在大多数情况下<
/p>
GST
融合蛋白是完全或部分可溶的。
纯化:
该表达系统表达的
GST
标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷
胱甘肽琼脂糖凝胶<
/p>
(Glutathionesepharose)
亲和树脂进行纯
化。
GST
标签蛋白可
在温和、非变性
条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。
GST
在变
性
条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,
因此不能在纯化缓
冲液中加入强变性
剂如:盐酸胍或尿素等。
< br>如果要去除
GST
融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除
。
检测:可用
GST
抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。
HA
HA
标
签蛋白,
标签序列
YPYDVPDYA
,
源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定
簇,
9
个氨基酸,对外源靶蛋白的空间结构影响小
, <
/p>
容易构建成标签蛋白融合到
N
端或者
p>
C
端。易于用
Anti
-
HA
抗体检测和
ELISA
p>
检测。
c-Myc
C-Myc
标
签
蛋
白
< br>,
是
一
个
含
11
个
氨
基
酸
的
小
标<
/p>
签
,
标
签
序
列
Glu-Gln-Lys-Leu-
Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu
,
这
11
个氨基酸作为抗原表位表达
在
不
同
的
蛋
白
质
框
架
中
仍
可
识
别
其
相
应
抗<
/p>
体
。
C-Myc
tag
已
成
功
应
用
在
Western-
blot
杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中
,
可用于检测重组蛋白
质在靶细胞中的表达。
eGFP/eCFP/eYFP/mCherry
分别是增强型绿色荧光蛋白
/
增强型黄绿色荧光
蛋白
/
增强型黄绿色荧光蛋白
/
单
体红色荧光蛋白
,
具有不同的激发波长发射波长为,均由野生型荧光蛋白通过氨
基酸突变和密码子优化而来
。就
eGFP
而言,相对于
GFP
p>
,其荧光强度更强、荧
光性质更稳定。同时载体中构建的
Kozak
序列使得含有
eGFP
的融合蛋白在真核
表达系统中表达效率更高。
mChe
rry
是从
DsRed
演化来的性能最
好的一个单体红
色荧光蛋白,可以和
GFP
系列荧光蛋白共用,实现多色标记体内、外实验表明,
mCherry
在
N
端和
C
端融合外源蛋白时,
荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能
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