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重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。特别是体内功能研究和蛋白质的大规模
生产都需要应用重组
蛋白表达载体。
美国
GeneCopoeia
的蛋白表达载体按照表达宿主的不
同新推出
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类，分别为表达宿主为大肠杆菌，哺乳动物细胞的，
以及慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。
除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体分别按照功能标签
的不同确定种类并将个标
签的功能初步介绍如下：
His6
：
His6
是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的
C
末端或
N
末端。当某一个标签的
使用，一是能构成
表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化
。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，
可用于固定化金属螯合层析
(IMAC)
，对重组蛋白进行分离纯化。
使用
His-
tag
有下面优点：
1.
标签的分子量小，
只有
~0.84KD
，而
GST
和蛋白
A
分别为
~26KD
和
~30KD
，
一般不影响目标蛋白的功能；
< br>
标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下
或变性条件下纯化，
前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，
后者
在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白
的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；
标签融合蛋白也被用于蛋白质
-
蛋
白质、蛋白质
-DNA
相互作用研究；
标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动
物进行免疫制备
抗体
；
5.
可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；
6.
可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。<
/p>
Flag:
Flag
标签蛋白为编码
8
个氨基酸的亲水性多肽（
DYKDDDDK
）
，同时载体中构建的
Kozak
序列使得带
有
FLAG
的融合
蛋白在真核表达系统
中表达效率更高。
FLAG
作为标签
蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有
利用
研究人员对融合蛋白进行下游研究。
2.
融合
FLAG
的目的蛋白，可
以直接通过
FLAG
进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以
纯化有活性的融合蛋白，并
且纯化效率高。
< br>
作为标签蛋白，其可以被抗
FLAG
的抗体识别，这样就方便通过
Western Blot
、
ELISA
等方法对含有
FLAG
的
融合蛋白进行检测、鉴定。
4.
融合在
N
端的
FLAG
，其可以被肠激酶切除（
DDDK<
/p>
）
，从而得到特异的目的蛋白。因此现
F
LAG
标签已广泛的应用于
蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及
其蛋白相互作用等相关领域。
MBP:
MBP
（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为
40kDa
，由大肠杆
菌
K12
的
malE
< br>基因编码。
MBP
可增加在细菌中过量表达
的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。
MBP
标签
可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标
签。如果蛋白在细菌中
表达，
MBP
可以融合在蛋白的
N
端或
C
端。
纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用
10mM
麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结
合亲和力在微
摩尔范围。一些融合蛋白在
0.2% Triton
X-100
或
0.25% Tween 20
< br>存在下不能有效结合，而其他融合蛋
白则不受影响。
<
/p>
缓冲条件为
pH7.0
到
8.5
，盐浓度可高达
1M
，
但不能使用变性剂。如果要去除
MBP
融合部分，可用
位点特异性蛋白酶切除。
检测：可用
MBP
抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。
GST:
GST(
谷胱甘肽巯基转移酶
)
标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为
< br>26KD
。将它应
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