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酵母表达系统的研究进展和前景
( XXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
学院
)
摘要
：
酵
母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，
表达出的重组蛋
白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。
近年来，<
/p>
利用酿酒酵母和毕赤巴
斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及
其它中间体取得了新的进展。
本文主要从上游设
计，
重组表达，
分离纯化和活性验证等方面进行了总结，
并且对未来更好的利用酵母生产药
物等活性物质作出展望。
关键词
：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人
源活性药物
引言
酵母作为一种表达外源基因的宿主菌
,
既具有操作简单
,
生长快等特点
,
又具有真核细
胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时
,
可以大规模生产
,
从而有效地降低<
/p>
成本。
常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统
< br>,
甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达
系统。酿酒
酵母
（
Saccharomyces.
cerevisiae
）
在分子遗传学方面被人们的认识最早，
也是
最先作为外源基因表达的酵母宿主。
但由于酿酒酵母的局
限，
1983
年美国
Wegner
等人最先
发展了以甲基营养型酵母
（<
/p>
methylotrophic yeast
）
< br>为代表的第二代酵母表达系统。
其中毕赤酵
母
（
P.
pastoris
）
是继
S.
cerevisiae
之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。
酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于
30 kD<
/p>
的外源蛋白质，
也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表
达蛋白质的
C
端往往被截短。因此，一般
不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
但是，
可以通过基
因敲除或改造用酿酒酵母表达
亚单位疫苗
(
如
HBV
疫苗、口蹄疫疫苗等
)<
/p>
或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）
。
与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有
以下优点
[1]
：
（
< br>1
）生长速率快，易于高密度培养（
2
< br>）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率
（
3
）消除了内源毒性和噬菌体感染
（
4
）
易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作
（
5
）
对毕赤酵母的噬菌体对人没有
病原性（
6
）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙<
/p>
酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（
7
）能够构建分泌的蛋白，这样只
需从生长培养基中提纯而不必收集酵母
本身细胞。
基因工程与酵母表达系统
即使酵母表达系统具有一些优势，
但在用于生产蛋白质等药物时，
还需要选择合适的载
体并对宿主菌的某些代谢途径进行改造，
使之利于目标产物的表达，
要用于工业生产，
还
需
根据实际情况优化培养条件，比如
pH
，温度，溶氧量，培养基营养，特殊添加剂等。
酿酒酵母的
表达载体有自主复制型和整合型，自主复制型质粒通常有
30
个
或更多的拷
贝，
含有自动复制序列
(a
utomaticreplicating sequence
，
ARS)
，
能够独立于酵母染色体外进行复
< br>制
，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型
质粒不含
ARS
，必需整合到染色体
上
，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了
p
MIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin
yeast)
质粒，旨在将目的基因靶向整合到
rDNA
簇上
(rDNA
簇为酵母基因组中串联存在的
150
个重复序列
)
< br>，因此利用
pMIRY2
质粒可以
得到
100
个以上的拷贝。值得注意的是，酿酒酵母表达的外
源蛋白质往往被高度糖基化，糖
链上可以带有
40
个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅
1,3
甘露糖，致使
产物的抗原性明显增强。
毕赤酵母的表达载体多采用整合型载体，即将异源基因通过载体整合进酵母基因组中，
这是由于没有适合毕赤酵母的游离型表达载体。
所有巴斯德氏毕赤酵母的表达
载体都是一个
表达组件，它由一个启动子序列
（大多是
AOX1
启动子）
，
一
个来自
AOX1
的转录终止序列用以
指
导
3
’
终止过程和
mRNA
的多聚腺苷酸化，在它们之间有一个或多个克隆位点用以插入外源
基因。这样的设计保证了产物
(
cap-
AOX1
5
′
UTR-
ORF-3
′
UTR-polyA
)<
/p>
是一个成熟的
mRNA
以
适应毕赤酵母的细胞体系，
确保了信息的稳定性和有效性。
检测表达所用的标记基因一般是
HIS4
（组氨醇脱氢酶基
因）
，有时也用
kan
（卡那霉素抗性基因）或
Sh
ble
.
此外，有时为了
防止酵母自
身蛋白酶对所要表达的异源蛋白的降解，
会使用蛋白酶缺陷突变型或降低发酵温
度，
保证目的蛋白的产量和得率。
发酵过程一般
分两个阶段，
第一阶段是细胞以甘油为碳源
生长，甘油耗尽后进
入第二阶段，加入甲醇诱导
AOX1
启动子的转录翻译，从而使
异源基因
表达，生产目标蛋白。
酵母表达系统研究进展
1
．
利用酿酒酵母生产青蒿素前体——青蒿酸
青蒿素（
Artemisinin
）是目前治疗疟疾的高效
药物，这主要是由于疟原虫（
Plasmodium
falc
iparum
）逐渐对其它药物产生了抗药性。现在青蒿素的产量远达不到需求量，所以
Jay D.
Keasling
<
/p>
等人
通过酿酒酵母生产它的前体——
ar
temisinic
acid
，成本低，环保，可作为高质<
/p>
[2]
R
量和可靠的青蒿素来源。这个实
验通过改造甲羟戊酸途径，引入两个来自青蒿（
Artemisia
< br>annua
）的
外源酶
amor
phadiene synthase
(ADS)
和
cytochrome P450 monoox
ygenase
(
CYP71AV1
)
使
酿酒酵母获得将
amorpha-4
,11-diene
氧化为
artemisinic
acid
的三步途径。同时，还导入了
CYP71AV1
的天然氧化还原配体
CPR<
/p>
(
cytochrome
P450
oxidoreductase
)
，<
/p>
在这之前，
还需将法尼
基焦磷酸即
FPP
（
farnesyl pyropho
sphate
）
的合成途径修饰，减少它用于固醇的合成，使之
更
多的用于合成
amorphadiene
。然后，利用改造的酿酒酵母
EPY224
生产
artemisinic
acid
，不仅纯
度较高，易于提取分离，而且不受气候影响。
2
．利用毕赤巴斯德氏酵母生产人源抗菌肽——
LL-37
抗菌肽是生物体抵御外源性病原体的防御反应中所产生的一类小分子多肽。
许多传统的
抗生素具有毒副作用且能够诱导耐药菌株的产生，
发展克服耐药性问题的新型抗生素显得越
来越重要。抗菌肽具有分子质量小、水
溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广和作用机
制独特等特点，还有研究表明，
hCAP
（
Human
cathelicidin antimicrobial peptide
）是人皮肤
在受伤或炎症刺激下，嗜碱性粒细胞分泌的一种防御或抗微生物的肽，在人类中只有
LL-
37
一种。
固相化学合成技术可以生产像肽这样较短的氨基酸序列，
不过成本太高。
Yong-
Seok
Kim
等人
[3]
利用
pGAPZ
-E
（
pGAPZB
载体
的游离形式）将编码成熟
LL-37
的
111bp
的基因片段采用电
穿孔方法转化到
< br>P. pastoris
X-
33
中，进行细胞内表达，表达的重组
LL-37
通过
LC-
ESI
-MS/
MS
检
测确定，发现有
5kDa
的
LL-
37
条带。
酵母的表达出来的
LL-37
的粗提取物对
Micrococcus luteus
具有抑制活性。表达载体采用
GAP
强启动子，另外还进行了有
a-
MF
外分泌信号的载体
pGAPZaA
，结果采用这个载体的
X-33
培养物中没有发现胞
外分泌的
LL
-
37
< br>.
另外还利用蛋白酶
缺陷型菌株
SMD1168H
进行了转化，
LL-37
在其中的表达水平与在
X-33
中的没有显著差异。这
个实验说明了利用游离型表达载体在
P.
pastoris
X-
33
中可以成
功表达
LL-37
，并且具有生物活
性
，可以用于生产这类抗菌肽药物。
3
．人源化的毕赤酵母生产糖蛋白类药物
人体内，
除了抗体外的大多数糖蛋白的半衰期和治疗潜力依赖于末端的唾液酸化，
这是
由于一个糖蛋白的其它末端糖比如甘露糖，
N-
乙酰葡糖胺和半乳糖等会被体内的糖特异性受
体或凝集素识别并被清除，
也就失去疗效了。
酵母和丝状真菌在表达这类糖蛋白方面具有一
定前景。用酵母表达在人体内具有活性的糖蛋白需要进行很多基因删除或修饰，
Tillman
U.
Gerngross
等人
[4]
利用毕赤酵母构建出能表达重组红细
胞生成素（
EPO
）的菌株
P.
pastoris
YSH597
。
这
个菌株是在以前的菌株
RDP762
基础上利用
pSH926
载体引入了
5
个
新的外源基因
构建成的，
为的是使这个酵母能完成人源的末端唾
液酸化。
对天然酵母的改造设计到四个酵
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