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分子标记
1.
分子标记技术及其定义
1974
年
,
Grozdicker
等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒
DNA
突变体时
,
利
用限制性
内切酶酶解后得到的
DNA
片段的差异
,
首创了
DNA
分子标记。所谓分<
/p>
子标记是根据基因组
DNA
存在丰富的多
态性而发展起来的可直接反映生物个体
在
DNA
水平上的差异的一类新型的遗传标记
,
它是继形态学标
记、细胞学标记、
生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义
的分子标记是指可遗传的并可检测
的
DNA
序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以
DNA
多态
性为基础的遗
传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体
在基因或基因型上所产生的变异来反映
基因组之间差异。
2.
分子标记技术的类型
分子标记从它诞生之日起
,
就引起了
生物科学家极大的兴趣
,
在经历了短短
几十年的迅猛发展后
,
分子标记技术日趋成熟
,
现已出现的分子标记技术有几
十种
,
部分分子标记技术所属类型如下。
2.1
建立在
Southern
杂交基础上的分子标记技术
(
1
)
RFLP
(
Rest rict
ion Fragment Length Polymorphism)
限制性内切酶片段长度
多态性标记；
(
2
)
CISH
(
Chromosome
In Situ Hybridization
)
染色体原位杂交。
2.2
以重复序列为基础的分子标记技术
(
1
) (
Satellite DNA
)
卫星
DNA
；
(
2
) (
Minisatellite DNA
)
小卫星
DNA
;
(
3
)
SSR
(
Simple
Sequence Repeat
)
简单序列重复
,
即微卫星
DNA
。
2.3
以
PCR
为基础的分子标记技术
(
1
)
RAPD
(
Randomly
Amplif ied Polymorphic DNA
)
随机扩增多态性
DNA
；
(
2
)
AFLP
(
Amplif ied
Fragment Length Polymorphism
)
扩增片段长度多态性；
(
3
)
SSCP
(
Single
Strand Conformation Polymorphism
)
单链构象多态性；
(
4
)
cD
NA
-
AFLP
(
cDNA- AmplifiedFragment
Length Polymorphism
)
cDNA -
扩
增片段长度多态性；
(
5
)
TRAP
(
Target
Region Amplified Polymorphism
)
靶位区域扩增多态性；
(
6
)
SCAR
(
Sequence
Char acterized Amplified Region
)
序列特征化扩增区域；
(
7
)
SRAP
(
Sequencerelated
Amplified Polymorphism
)
相关序列扩增多态性。
2.4
以
m
RNA
为基础的分子标记技术
(
1
)
ESTs
(
Expressed
Sequence Tags
)
表达序列标签；
(
2
)
DD
(
Differential
Dislay
)
差异显示；
(
3
)
RT-PCR( Reverse T ranscription PCR
)
逆转录
PCR
；
(
4
)
DDRT-PCR
(
Differential Display Reverse
Transcription PCR
)
差异显示逆转
录
PCR
；
(
5
)
RAD
(
Representative Difference Analysis
)
特征性差异分析；
(
6
)
SAGE
(
Serial
analysis of gene expression
)
基因表达系列分析。
2.5
以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术
SNP
(
Single
Nucleotide Polymorphism
)
单核苷酸多态性标记。
2.6
以特定序列为核心的分子标记技术
mtDNA
(
Mitochondrial DNA
)
线粒体
DNA
分子标记。
3.
代表性分子标记技术
3.1
RFLP
限制性片段长度多态性
RFLP
(
Rest rict
ion Fragment Length Po ly
mor
phism
)
作为最早的分子标
记
技术由
Grozdicker
创立
,
并于
1980
年由
Bostein
再次提出
[ 3]
。其原理是限
制性内切酶能识别并切割基因组
DN A
分子中特定的位点
,
如果因碱基的突变、
插入或缺失
, <
/p>
或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消
失
或新的酶切位点的产生。
那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组
DNA
,
就可以得到长短、数量、种类不同的限
制性
DNA
片段
,
通过电泳和
So
uthern
杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上
,
选用一定的
DNA
标记探针与之杂
交
,
放射自显影后就可得到反映个体特异性的
DNA
限制性片段多态性图谱。
RFL
P
分析中所使用的探针通常是随机克隆的与被检测物具有一定
同源性的单
拷贝或低拷贝基因组片段或
cDNA
片段。其中
cDNA
探针保守性较强
,
许多同
科物种
cDNA
探针都可以作为通用探针。
RFLP
标记技术的优点是
:
(
1
)
标记广泛存在于生物体内
,
不受组织
、环境
和发育阶段的影响。
(
2
)
RFLP
标记的等位基因是共显性的
,
不受杂交的影响
,
可区分纯合基因与杂合基因。
(
3
)
可产生的标记数目很多
,
可覆盖整个
基因组。
但是
RFLP
标记技术需要酶切
,
对
DNA
质
量要求高
;
由于编码基因具有相当高
的
保守性
,
RFLP
的多态性程度偏低；分子杂交时会用到放射性同位素
,
对人体
和环境都有害
;
探针的制备、
保存和发放也很不方便。
此外
,
分析程序复杂、
技
术难度大、
费时、
成本高。
所以
,
RFLP
标记技术的应用受到一定限制
。
目前
RFLP
标记技术已经在基因突变分析、基因定位、基因诊断、个体识别、亲缘鉴定、物
种分
类和进化关系研究
,
以及组建高密度的遗传图谱和育种操作等
方面都有一
定的应用和重要的实用价值。
3.2
CISH
(
Chromosome
In Situ Hybridizatio
n)
染色体原位杂交
原位杂交技术最早是由
Gall
和
Pardue
利用标记的
rDNA
探针与非洲爪蟾细
胞核杂交建立起来的。
其中染色体原
位杂交在原位杂交技术中应用最广泛
,
它是
< br>一种基于
Southern
杂交的分子标记技术。该技术利用特异性核酸片段作探针
,
直接同染色体
DNA
片段杂交
,
在染色体上显示特异
DNA
。可采用同位素标记
探针
,
杂交后通过放射自显影显示杂交信号
,
也可以采用非放射性大分子如生
物素、地高辛等标记特异核酸片段
,
杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示原
位杂交的优点
是准确、直观
,
缺点是技术非常复杂。
3.3
SSR
(
Simple
Sequence Repeat
)
简单序列重复
,
即微卫星
DNA
微卫星是指以少数几个核苷酸
(
1~
6
个
)
为单位多次串联重复的
DNA
序
列
,
亦称简单序列重复
(
SSR
)
。
这种序列存在于几乎所有
真核生物的基因组中
,
含量丰富
,
且呈随机均匀分布。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。
保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域
,
核心序列重复数的差
异则形成微卫星的高度多态性
,
这种多态性的信息量是比较丰富的。
该技术即是
基于基因组
DNA
重复序列的差异进行检测
,
不受组织
,
器官种类、环境条件等<
/p>
因素影响。
近年来
,
微卫星作为一种分子标记
,
已成为种
群研究和进化生物学最
常用的分子标记之一
,
广泛地应用于生物杂交育种、
遗传连锁图谱、
种群遗传
多
样性、系统发生等研究领域。
对于大多数物种
,
在第一次开展微卫星研究时首先需要分离微卫星序列
,
开发特异性扩增引物。目前
，
关于微卫星分离
方法的研究报道很多
,
概括起来基
本上
分为经典法、富集法、省略筛库法、
ISSR
片段扩增法和数据
库检索法
5
种。
微卫星具有分布广泛、
多态性丰富、
杂合度高、
通用性好以及
扩增反应所需模板
量少、重复性好的优点
,
而且呈共显性遗传、检测方便、结果稳定。但是
,
微卫星<
/p>
标记的诸多优点同时也增大了基因型错误判别的可能性。无效等位基因
( null
allele)
、
“结巴”带
( stutter
bands)
、短等位基因显性
(
short allele dominance)
和
等位基因的“扩增丢失”
(
allelicdropout
)
现象的发生都可能导致微卫星基因型
的鉴定错误。
3.4
RAPD
随机扩增多态性
DNA
RAPD ( Randomly Amplif ied Po lymo
rphicDNA )
是由
Williams
和
Welsh
两个
研究小组于
1990
年分别研究提出的一种分子标记
,
是建立在
PCR
基础上的一种可
对整个未知序列的基因组进行多态性分析的
DNA
分子标记技术。基本原理是利
用一个随机引物
( <
/p>
一般为
10
个碱基
)
通过
PCR
反应非定点地扩增<
/p>
DNA
片段
,
然后
扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分离后配合溴化乙锭染色或银染
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