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miRNA
研究方法
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miRNA
芯片
miRNA
简介
小
RNA
是
1
9~28nt
的调控
RNA
分子，主要
包括微
RNA(micro
RNA
，
miRNA)
和小干涉
RNA(short
interfering
R
NA
，
siRNA)
两类，其中的
miRNAs
成为继
siRNAs
之后新的研究热
点之一，名列
2002
年和
2003
年美国
《科学》杂志评出的年度十大科学成就。
miRNAs
是长片段
RNA
序列的一部分，同
siRNAs
一样是比较短小的单链小分子
RNA
，一般
来源于染色体的非编码区域，由大约
70 nt
大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过
与其目标
mRNA
分子的
3
端非编码区域
(3-untranslated
region
，
3 UTR)
互补导致
该
mRNA
分子的翻译受到抑制。
<
/p>
在
miRNA
公共数据库
miRBase (/)
中已经有
1W
多条来自不同物种
的
miRNA
序列
。
MiRNA
检测方法
要了解
miRNA
在基因调控中扮演的角色，很关键的
一个方法就是迅速、准确地定量检测
miRNA
基因的表达。因
此，
miRNA
表达水平的检测也成为了科学家们研究的热点。
但是由
于小分子
RNA
是一类很小的分
子，部分小分子
RNA
表达水平可能很低，
因而需要极为灵敏
而定量的分析工具。常用的检测方法有：
1. Northern blotting
2.
核糖核酸酶保护分析以及基于此方法的液相杂交。
-PCR
也被用来检测
miRNA
前体的表达水平，
其他基于
PCR
技术检测
miRNA
的方法有<
/p>
引物延伸法，就是在引物的
5
末端加一
个特异标记，可以定量测定低丰度的
RNA
含量；原
位杂交技术（
CISH,FISH
）可以方便的检
测
miRNA
的时空表达的差异。
<
/p>
4.
芯片
(microarrays)<
/p>
技术是一种较快的研究
miRNA
表达的
方法。
这里我们主要以美国
signosis
的“人
miRNA
芯片检测试剂
I
”为例来介绍
< br>miRNA
的芯片技
术的原理。
miRNA
在三个方面与信使核糖核酸不同：
< br>
(1)
miRNAs
是相当小的分子，丰度差异较大
(2)
成熟
miRNAs
与其
前体
pre-miRNA
和
primi
RNA
共存，只是长度不同
(3)<
/p>
许多
miRNAs
序列非常接近，例如同
源分子，只是一个或几个核苷酸不同。
所以，
常规
芯片技术不能直接用于分析这些分子。
一些
miRNA
芯片产品市面上也可买到，但是
这些产
品或者繁琐需预分离
microRNA
< br>，或者缺乏分辨力不能区分同源之间的差异，或者对低丰度
的
miRNAs
不够敏感。
对每一个
miRNA
分子，有二条引物
（
oligo
）来识别，每条引物只识别
miRNA
一半的
序列。其中的一个引物中含有标示序列（<
/p>
Tag
）
，另外一个引物含有
T7
启动子序列。只有序
列完全匹配的时候，两条
引物才能和
miRNA
杂交，形成
RN
A/DNA
的杂合体。即使只有一
个核苷酸不匹配都会造成杂交
或者随后连接的失败。这也是
T7-OLA
技术产品可分辨同源
miRNA
的原因。
为了增加分子的稳
定性，
该
DNA/RNA
杂合体被延伸
了一段序列
（加入的另
一对寡核苷酸与上述引物在
T7
和
Tag
部位互补）<
/p>
。含有生物素（
biotin
，
B
）的短序列通过
互补结合到其中的一条引物上
。
通过结合有亲和素
(Streptavidin)
的磁珠分离出杂合体。
然后，
两引物在
T4
连接酶的作用下，被连接成一个
DNA
片断。随后经过线性扩增（转录）
，含有
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