Q-PCR实时定量PCR完全手册

2021年2月27日发(作者：答应)

实时定量

PCR

完全手册

方法简介

所谓的实时荧光定量

PCR

就是

通过对

PCR

扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实 现对

起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量

PCR

反应中，

引入了 一种荧光化学物质，

随着

PCR

反应的

进行，

PCR

反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，

< p>
这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

RT- qPCR

是由三个步骤组成

:

1.< /p>

反转录

:

依赖反转录酶将

RNA

反转录成

cDNDA;

2.

扩增

:

用

PCR

的方法扩增

cDNA;

3.

检测

:

实时检测和定量扩增的产物

.

RT- qRCR

影响分析可靠性关键点

(Key porint):

1.

分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计

2.

反转录反应的非标准化影响试验 的稳定性

3.

数据分析应该高度客观 ，

如果不合理的分析，

从分析结果中会得到混淆的错误结果，< /p>

因此通过对

RT-qPCR

的每一组分进 行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的

指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。

存在的问题

由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：

1.

新鲜、冰冻、甲醛固定的样品

< /p>

2.

整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞

3.

总

RNA

或者

mRNA

反转 录成

cDNA

的不同的引发策略

5.

不同的酶以及酶的不同组合

6.

变异系数、灵敏度

7.

多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。< /p>

8.

每一步骤缺乏标准化分析流程造成 了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严

重影响

RT-qPCR

的可信度，重复性。

RNA

质量评价

现

在

RNA

定

量

的

程

序< /p>

很

多

。

最

近

EMBO

qPCR

course

(/jss/EmblGroupsOrg/conf_28)

比

较

了

用

R ibogreen,

Agilent

BioAnalyser

,

spectrophotometer

,Nanodrop and

the BioRad Experion

来定量同 样的样品。结果显示没有哪两种方法得到

同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是 不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成

所有

R NA

样品的评价。

RNA

质量

RNA

质量主要包括

RNA

的纯度

（没有蛋白质和

DNA

< br>的污染）

以及完整性。

传统的

R NA

质量的评价通过分

析

A260/A 280

的比值或者对琼脂糖凝胶电泳

rRNA

< br>的条带的分析。

Agilent Bioanalyser/BioRad Experion

微

流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方 法。

Agilent

的

2100

也是一种十分好的分析

RNA

质量的方法，它

通过分析

18S

以及

< br>28S rRNA

的分析图谱，通过图谱来反应

RNA< /p>

的量和完整性，其完整性通过完整性系数