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量实验表明,针对同一靶基因的不同
siRNA
序列具有不同的沉默效率,为了能够运用
RNAi
技
术更有效地沉默靶基因,
需要在
RNAi
的第一步,
也是其成功与否的关键环节
―siR
NA
序列的设
计方面进行更多的改进。本文将在以下几个方面探
讨
siRNA
序列设计方面的最新研究进展,作
为应用
RNAi
技术时的参考。
RNAi
最终要通过
siRNA
片段与靶基因结合并使之降解,
因此,
确保高度同源于靶基因而绝无与
其他基因同源的
siRNA
序列,是决定
RNAi
特异性的关键所在,也是
siRNA
设计的基本原则。
p>
从具有不同沉默效率的
siRNA
序列中筛
选出高效的
siRNA
序列,
需要经过
严密的设计和不断的
实验检验
[1]
。
序列在靶基因中的位置
从靶基因起始密码子
AUG
下游
50
~
100
p>
个核苷酸开始搜寻理想的
siRNA
序列,
越靠近靶基因
的
3′
端,其基因沉默效
果可能越好
[2]
。以前的研究表明:不要以
< br>5′
非翻译区(
5′UTR
)和
3′
非翻
译区(
3′UTR
)及起始密码子附近序列作为设计
siRNA
p>
的模板,这些区域含有调节蛋白结合位
点
(
如翻译起始复合物
)
,调节蛋白可与<
/p>
RISC
竞争结合
siRNA
序列,降低
RNAi
效应
[3]
;也要避
开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性
(SNP)
区域。最近,
Yokota
等发现在
HCV(
丙型
肝炎病毒
)
基因组中,
5′U
TR
是一个高度保守区,使之成为
siRNA
< br>理想的靶点。运用
RNAi
技术
作用于
5′UTR
或
3′UTR
序列,同样可引起靶基因沉默
[4,5]
,这
些发现使基因功能分析领域扩展
到
5′UTR
< br>和
3′UTR
内。
2.
siRNA
序列的起始碱基与长度
SiRNA
序列最好为
AA(N
n)UU(N
代表任意碱基;
n
为碱
基数目,
在
19
~
29 nt
之间
)
,
NA(N n)
UU
和
NA(N n) NN
序列也可以。
以前的研究表明,
典型
siRNA
的三大结构特征是:
长度为
21
~
23 nt
;<
/p>
siRNA
双链的
3′
< br>端各有两个突出碱基;
siRNA
双链的
5′
端有磷酸基团。以
AA?N19
标准
设计的
siRNA
,在哺
乳动物细胞中
70%
~
80%
可产生
RNAi
作用。但是一些具有较小脱靶
效应
的
siRNA
序列不是以
AA
为起始的,所以现在不推荐以
“AA
为起始
”
作为选择标准之一
< br>[6]
。最新
研究表明
[7,8
]
,
27
nt
或
29 nt
的
< br>siRNA
与
21 nt siRNA
< br>相比:
(
1
)
< br>其抑制活性可提高数倍以上;
(
2
)不易于诱导干扰素反应和激活
PKR
;
(
3
)一些基因对
21
nt
siRNA
不敏感,但是可以被
27
nt siRNA
有效的抑制;
(
4<
/p>
)与
21 nt
SiRNA
相比,
27 nt SiRNA
对靶基因的最大抑制率可在
相对低的浓度下得到。另外,在选择
siRNA
序列时,要考虑到所用启动子的类型。
U6<
/p>
启动子
要求转录产物的第一个碱基是
G<
/p>
,
正反义链均如此;
H1
启动子转录产物的第一位碱基为
U
、
< br>G
、
C
均不影响基因的沉默效果
[9]
。
3 .siRNA
3′
端突出碱基的选择
当
siRNA
的
3′
端突出碱基为
UU
时,其基因
抑制效率最高;但是
3′
端的突出碱基不能为
< br>G
,因
为
RNase
会降解以
G
为末尾的
RN
A
单链。
Elbashir
等[
p>
2
]建议用
dTdT
取代
3′
端的
2
个碱
基突出,增强
siRNA
双链复合体的稳定性。需要注意的是,由于双链
siRNA
中的正义链不参与
对靶
mRNA
< br>的识别,所以正义链的
3′
端突出碱基可以用
dTdT
替代,但是反义链
3′
< br>端突出碱基
必需与靶
mRNA
序
列相同的。
4
.siRNA
序列中
G/
C
含量的选择
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