-
ＸＸ大学毕业论文
题
目
：
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白
MOG
抗原肽
免疫原性验证
学生姓名：
XXX
学号：
XXXXXXXXX
指导教师：
XXX
职称：
教授
专
业：
生物技术
院（系）
：
生物工程系
完成时间：
201
1
年
5
月
25
日
2011
年
5
月<
/p>
25
日
摘要
目的：
通过实验性自身免疫性脑脊髓炎（
Experimental
autoimmune encephalomyelitis, EAE
）
小鼠模型的建立，验证固相合成法制备的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（
MOG
）抗原肽免疫
原性。并通过观察
EAE
病理学变化，初步探讨多发性硬化（
MS
）的发病机制。
方法：
本实验室利用
Fmoc
固相合成法制备的
MOG
35~55
抗原肽（纯度
>95%
）加完全弗氏
佐剂
（
CFA
）
免疫
C57BL/6
小鼠，
观察小鼠发病情况，
< br>并采用双盲法进行神经功能评分。
利用电子显微镜观察
E
AE
小鼠的病理学变化，分别采用
HE
染色、
Luxol Fast Blue
髓鞘
< br>染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。
结果：
MOG
35~55
成功诱导了
C57BL/6
小鼠
EAE
模型。
免疫后
15
天起，
小鼠开始陆续出现
临床症状，至第
21
天发病率达
1
00%
。电子显微镜下可见
EAE
小鼠
脊髓中典型脱髓鞘
现象，并伴随有典型的炎性细胞的浸润。
结论：
用本实验室合成的抗原肽
MOG
35~55
诱导的
< br>C57BL/6
小鼠
EAE
模型
，发病率高，模
型稳定，
为进一步研究多发性硬化
（
multiple sclerosis,
MS
）
的发病机制与治疗打下基础。
关键词
：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、实验性自身免疫性脑脊髓炎
、动物模型、神经病理
学
I
Abstract
Objective
The model of
experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) was
established in female
C57BL/6 mice to
validate the immunogenicity of myelin
oligodendrocyte glycoprotein (MOG),
to
observe pathological changes of EAE, and to
explore the possible pathogenesis of multiple
sclerosis(MS).
Methods
Each mouse was injected s.c over flanks
with MOG
35-55
, Mycobacterium
H37Ra, and CFA,
injected
i.p
with
pertussis
toxin.
The
clinical
symptoms
were
observed
and
the
pathological
changes of EAE were studied with the
electron microscopy. Consecutive sections were
stained
with
hematoxylin/eosin(HE)
and
Luxol
Fast
Blue(LFB),
to
assess
inflammation
and
demyelination.
Results
The
incidence
of
EAE
in
immunization
animal
reached
100%,
most
mice
developed
clinical
EAE
with
in
about
15
days
of
immunization
MOG
35~55
peptides.
With
Electron
microscopy,
inflammatory
cells
in
white
matter
and
demyelination
were
observed.
And
the
component
of axon is disappeared.
Conclusion
The
immunogenicity
of
MOG
35~55
synthesized
by
the
improved
solid-phase
synthesis
method was identified by the induction
of EAE in C57BL/6 mice with stable performance and
high
incidence,
which
may
be
helpful
in
exploring
the
mechanism
and
therapy
of
Multiple
sclerosis(MS).
Key
Words:
Myelin
oligodendrocyte
glycoprotein(MOG),
Experimental
autoimmune
encephalomyelitis(EAE), Mouse models,
Pathological changes
II
目录
引言
.........................
..................................................
..................................................
.............................................
1
一、材料和方法
.......
..................................................
..................................................
................................... 2
1.
试剂和仪器
.
.................................................
..................................................
...............................................
2
1.1.
主要试剂
.
..................................................
..................................................
.............................................
2
1.2
主要仪器
............
..................................................
..................................................
.................................... 2
2.
实验动物
.......................
..................................................
..................................................
............................ 2
2.1
小鼠来源
< br>............................................... .................................................. .................................................. . 2
2.2
饲养
.........................
..................................................
..................................................
............................... 2
3.
EAE
小鼠模型的制备
.
.................................
..................................................
...........................................
3
4.
神经功能评分
.
................................................ .................................................. ........................................... 3
5.
脊髓组织病理学检测取材
................
..................................................
..................................................
.. 3
6.
溶液的配制
.
.................................................
..................................................
...............................................
3
7.
H
&E
、
LFB
染色
............................................... .................................................. ....................................... 4
7.1
H&E
染色
...........
..................................................
..................................................
......................................
4
7.2
LFB
染色
...........
..................................................
..................................................
......................................
4
8.
数据分析及统计学处理
.
............................................ .................................................. ............................ 5
二、实验结果与分析
..................
..................................................
..................................................
............. 5
1.
临床评分
.......................
..................................................
..................................................
............................ 5
2
病理学检测结果
....................
..................................................
..................................................
................... 6
2.1
H&E
结果
...........
..................................................
..................................................
......................................
6
2.2
LFB
的结果
.
................................................ .................................................. .............................................. 7
三、讨论
.................................................
..................................................
..................................................
.......... 8
参考文献
.......................................
..................................................
..................................................
.................. 10
致谢
.........................
..................................................
..................................................
...........................................
12
III
引言
实验性自身免疫性脑脊髓炎（
experimental
autoimmune encephalomyelitis,
EAE
）是研
究多发性硬化（
multiple
sclerosis, MS
）的经典动物模型，是由同种型、同种异型、异种型
神经组织抗原诱导的中枢神经系统
(central
nervous
system,
C
NS)
白质免疫炎性脱髓鞘性模
型。其病理特征和
MS
相似，均表现为
CNS
白质脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。
制备
EAE
动物模型的方法多种多样，可通过注射
CNS
髓鞘、特定的髓鞘蛋白或其选
择肽段加完全弗氏佐剂主动诱导；或转移已
致敏的
CD4+T
细胞进行过继免疫诱导。诱导
EAE
由于不同的致敏原，
动物品系或诱导方法可以诱
导产生不同类型或不同程度的
EAE
，
所以制备
EAE
动物模型的方法多种多样。目前报道较多的
EAE
模型动物是
Lewis
大鼠、
SJL/J
小鼠、
<
/p>
小鼠和
PL/J
小鼠等。但国内不易获得
这些啮齿类动物，因而在制作
EAE
动物模型时均不作为首选。
C57BL/6
小鼠也是具
EAE
敏感特性的品系之一，
其对髓鞘少突胶质
细胞糖蛋白
(MOG)
的敏感抗原表位是
35~55
位氨基酸。
MOG
35~
55
抗原肽含
21
个氨基酸，分子量为
2582.4
道
尔顿，是唯一既能引起
脱髓鞘抗体反应又能引起
T
细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成
分。
虽然
MOG
在髓鞘蛋白中含量很少，
但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，
故具有高度免疫原性。近年来用
MOG
诱导的
EAE
逐渐成为国际上研究
MS
的主要模型。
参照国内外文献报道的方法，结合本实验室的条件加以改进，
拟采用
MOG
35~55
作为抗原，<
/p>
辅以腹腔注射百日咳毒素，以期成功构建
C57BL/6
小鼠
EAE
模型，来验证其免疫原性；
并采用双盲法进行神经功能评分，利用电镜观察
EAE
< br>小鼠的病理学变化，分别采用
HE
染色、
Luxol Fast Blue
髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘
脱失的情况。
1
一、材料和方法
1.
试剂和仪器
1.1.
主要试剂
MOG
35-55
多
肽
MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
由
本
实
验
室
合
成
，
合
成<
/p>
纯
度
HPLC>95%
< br>，完全弗氏佐剂（
CFA,
Chodrex
），百日咳毒素（
Pertussis
toxin,
Sigma
），结
晶紫
Cresyl
viole
（
Sigma
）
，
碳酸锂
(
上海华硕精细
化学品有限公司
)
，
坚牢兰
Luxol-fast-blue
（
Alfa A
esar
），伊红
Y(kermel)
，
PBS
缓冲液（
0.01M
，
PH7.4
），苏木素（郑州派尼化学
试剂厂），多聚赖氨酸（
Sigma
），多聚
甲醛（
Kermel
），无水乙醇，甘油。其它试剂均
为国产分析纯。
1.2
主要仪器
TDL80-2B
离心机（
Anke
），超净工作台（苏州净化设
备有限公司），电子天平
（
Sartorius
），微量移液器（德国
Eppendorf
公司），<
/p>
4
°
C
冰箱（<
/p>
Siemens
），微波炉（海
尔），冰
盒，
2ml
、
5ml
< br>玻璃注射器（上海鸽牌玻璃厂），医用一次性三通管（德国贝朗
医疗股份有限公司
），
Olympus BX51
荧光显微镜（日本
Olympus
公司），
Leica
石蜡切片
机（
Leica
，<
/p>
RM2145
），手术器械（眼科剪、眼科镊、手术刀等）。
2.
实验动物
2.1
小鼠来源
健康
6~8
周龄的雌性野生型
C57BL/6(H-2
b
)
小鼠
(SPF
级
)
< br>共
16
只。体重
16~18g<
/p>
，购自
中国医学科学院血液学研究所实验动物中心，
许可证号：
SCXK
（津）
2004-0001
。
正常组：
8
只，不作任何处理，
EAE
病理模型组
8
只，诱导
EAE
模型。
2.2
饲养
在ＸＸ大学生物工程系
SPF
级动物房中饲养、繁殖，幼鼠至八周龄后进行实验。
2
3.
EAE
小鼠模型的制备
C57BL/
6
小鼠随机分为
EAE
组和正常组，各
8
只。
MOG
35~55
多肽用
PBS
稀释后与完<
/p>
全弗式佐剂（结核杆菌的终浓度为
4mg/ml
< br>）按等体积混合，用注射器反复推拉成油包水
的乳剂，每只小鼠注射
0.2ml
乳剂，其中
MOG
35~55
多肽剂量为
300
μ
g/
只，分别于鼠背部
两侧皮下注射；
在第
1
次免疫后
0
小时和
48
小时腹腔注射百日咳毒素稀
释液
0.1ml
，
200ng/
只。正常组不做任何处理。
4.
神经功能评分
自免疫当天开始，每日
称体质量，观察小鼠的摄食情况，并从初次免疫第
0
天起至第<
/p>
31
天实验终止前，采用盲法，每天
2<
/p>
人至少
1
次在同一时间按
Benson
评分标准，对
EAE
严重性进行临床评估，评分≥
2
分以上者（包括
2
分）进行发病率的计算。
1
级：尾部无
力或蹒跚步态伴尾部有力；
2
< br>级：蹒跚步态伴尾部无力（共济失调）；
2.5
级：共济
失调
伴部分单肢麻痹；
3
级：
单肢完全麻痹；
3.5
级：
单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹；
4
级：
双肢完全麻痹；
4.5
级：四肢麻痹；
5
级：死亡。
5.
脊髓组织病理学检测取材
在
EAE
模型发病的高峰期，将小鼠脱颈处死，迅速取其脊髓，置于
4%
的多聚甲醛中
固定，
0.1mol/l PBS 24
小时、
70%
酒精
30
分钟、
95%<
/p>
酒精
I 60
分钟、
95%
酒精
II 60
分钟、
100%
酒精
I 60
分钟、
100%
酒精
II 60<
/p>
分钟、
60°
C
二甲苯
I 60
分钟、
60°
C
二甲苯
II 60
分
钟、
60°
C
石蜡
I 60
分钟、
60°
C
石蜡
II 60
分钟后
包埋。将石蜡包块用切片机连续切成
3~4
μ
< br>m
切片，分别作
H&E
染色、<
/p>
LFB
髓鞘染色。
6.
溶液的配制
6.1
Harris
苏木精的配制：
苏示精
1g
、硫酸铝钾
15g
、无水乙醇
10ml
、蒸馏水
< br>200ml
先用
蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，
用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，
煮
沸
1
分钟后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞
0.5g
。继续加热至浆夜变为紫红色。用纱布盖
瓶口，用前滤纸过滤后每
100ml
加冰醋酸
< br>5ml
。
6.2
乙醇性伊红液
Y
的配制：伊红
Y0.5g
、
90%
酒精
100ml
先将伊红溶于酒精，用玻棒研
3
碎溶解后，每
100ml
加冰醋酸
1
滴。
6.3
盐酸酒精分化液的配制：浓盐酸
0.5~1ml
、
75%
酒精
99ml
。
6.4
LFB
的配制：
LFB 1.0g
、<
/p>
95%
酒精
100ml
< br>、
10%
冰醋酸
5.0ml
混匀、过滤。
6.5 0.05%
碳酸锂的配制：碳酸锂
0.5g
、双蒸水
1000ml
。
6.6 0.25%Cresyl viole
结晶紫的配制：
结晶紫
0.25g
、
< br>双蒸水
100ml
、
10%
冰醋酸
1.0ml
混匀、
< br>过滤。
7. H&E
、
LFB
染色
7.1
H&E
染色
①
使用切片机将小鼠脊髓蜡块切为<
/p>
3-4
μ
m
厚，
用毛笔小心将其放入
45
℃水浴锅中展
片，
并用涂抹过蛋白甘油的载玻片将其捞出，置于
,60
℃烘箱中烘干（
3
小时）；
< br>
②
将切片依次直接放入有<
/p>
500ml
的
100%
< br>二甲苯的两个染缸中，各
5
分钟；
③
之后再将切片依次放入有
500ml
的
95%
酒精的两个染缸中，各
2
分钟；
④
结束后再将切片依次放入有
500ml
的
80%
酒精的染缸中，染色
1
分钟；
⑤
之后将其置入蒸馏水中，浸泡
1
分钟；
⑥
取出后置入有
500ml
的
Harris
苏木素
的染缸中，染色
5
分钟；
⑦
取出切片，快速用流水冲去多余<
/p>
Harris
苏木素液（
3s
）。
8
，将切片快速依次置入有
< br>500ml
的
1%
盐酸乙醇的两
个染缸中，各分化
2
秒，并用流水冲去多余染液，
20
分钟；
⑧
用蒸馏水冲一下，立即置入有
500mml
的伊红的染缸中，染色
2mi
n
；
⑨
<
/p>
用蒸馏水快速冲一下，
2
秒，之后依次过
80%
酒精，
2
秒，
95%
酒精
3
< br>秒，
95%
酒精
5
秒，
100%
酒精两次，各
5
分钟，二甲苯两次，各
3
分钟；
⑩
取出切片，
自然晾干，之后滴加适量的中性树脂封片，并用显微镜观察和摄像。
7.2 LFB
染色
①
使用切片机将小鼠脊髓蜡块切为<
/p>
3-4
μ
m
厚，
用毛笔小心将其放入
45
℃水浴锅中展
片，
并用涂抹过蛋白甘油的载玻片将其捞出，置于
60
℃烘箱中烘干（
3
小时）；
②
将切片依次直接放入有
500ml
的
100%
二甲苯的两个染缸中，各
7
分钟；
③
之后再将切片依次放入有
500ml
的
100%
酒精的两个染缸中，各
2.5
分钟；
4