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血涂片及骨髓涂片的制作与读片
潘志强
2006-3-30
实验准备
一.器材:
载玻片:每只动物一块
盖玻片:每只动物一块
滴管:
4
个
橡皮吸头:
4
个
中号镊子:
4
把
< br>
大剪刀:
4
把
眼科镊:
4
把
玻璃棒:
4
根
烧杯:
1000
ml
,
2
个
量筒:
100ml
、
< br>500 ml
、
1000
ml
各一
蜡笔
棕色小口瓶
碾钵
载玻片处理:
< br>一般将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸
20
分钟,
用流水冲洗,
再经清洁液浸
泡过夜,用流水反复
冲洗,最后入
95%
酒精浸泡约
1
p>
小时。取出,以洁净布巾夹持玻片边缘擦
干备用。
< br>
二.试剂:
瑞氏染液
240ml
瑞氏染料粉剂
0.1g
p>
纯甲醇(
AR
)
60ml
将粉剂放入洁净干燥碾钵内,
先加少量甲醇研磨使染料溶解,
然后将已溶解的染料倒入洁
净的棕色玻璃瓶内,剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨,如此
反复,直至染料完全溶解为止。
新配制的染液需密封保存,室温放置
1
周后才能使用。染料存放越久,染色效果越好。
磷酸盐缓冲液
p>
1%KH
2
PO
4
30ml
1%Na
2
HPO
4
20ml
加蒸馏水至
800 ml
,调
PH
值到
6.5~7.0
,定容至
1000ml
。
甲醇
鸡蛋
清:蒸馏水与鸡蛋清按
1/1
的比例稀释。
中性树胶:如果中性树胶过于粘稠,可将中性树胶与二甲苯按
7/3
的比例稀释。
二甲苯
1
实验步骤
一.涂片
(一)血液涂片的制作
(
1
)需载玻片
2
张,分别
称为玻片
1
和玻片
2
< br>(推片)
。
(
2
)用玻片
1
一端接约
3mm
直径的血滴,将此玻片
1
保持水平。
(
3
)取另一边缘平整的载玻片
2
(推片)
,将其前端放在血滴前,与片
1
保持
30
°角并稍向后
移与血滴接触,即见血液沿片<
/p>
2
(推片)下缘散开,使血液展开并充满整个推片的宽度。
(
4
)立刻将推片
与载玻片呈
30
°角,边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推
动涂抹,至血
液铺完血膜为止。
(<
/p>
5
)挥动片
1
使
血膜吹干,用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。
(
6
)每只动物涂片一张。
(
7
)一张良好的血片,要求厚薄适宜,头、体、尾分明。
(
8
)置
30min
~
1hr
后
较利于观察红细胞的形态。
注意事项:
?
如标本本身太短,可观察的部分会
受局限,故以在离开载玻片另一端
2cm
地方涂抹为宜。
?
载玻片、
p>
推片的角度越小、
血液越薄;
涂抹速度越慢
、
也越薄。
在涂抹贫血病人的血液时,
将推片稍竖起
(不
是
30
°而是
35
°~
40
°左右)
,以较快的速度推比较好,而对红细胞增高的病人则相反。<
/p>
?
如用力过猛白细胞容易破损。
(二)骨髓涂片的制作
用手术剪刀剪掉大腿部的肌肉,充分暴露股骨,再用大剪刀从上端剪断第
2
股骨,用中号
镊子夹股骨以挤出骨髓,
如果骨髓不易取出,
可用直头眼科镊插入骨髓腔挑出骨髓,置骨髓于
一载玻片上,由于骨髓液的纤维蛋白原含量较高,易于凝固,可先在骨髓液内加
5~
10
倍的稀
释后鸡蛋清,充分混匀,取
1
滴至另一载玻片上,涂片。涂片方法同血液涂片,但推片要快并
迅速使之干燥。每只动物涂片一张。
二.染色
(一)血液涂片的染色
(
1
)将待染涂片平放于染色架上。
(
2
)用滴管将染液滴于涂片上,覆盖整张涂片,放
置
1
~
3
分钟
。
(
3
)加
入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水,与染液混匀,可以用滴管从一端吸入,另一端放出,
混匀
为止,或用嘴来回轻轻吹之,使之混匀,室温下染色
5
~
10
分钟(白细胞数多或骨
髓标本时间应长一
些,如
20
~
30min
)
。
(
< br>4
)染色结束时,先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。
(
5
)再将片子用自来水
温和冲洗,至血液膜呈淡红色。
(
6
)甩干或晾干玻片。
(
7
)封片。
(二)骨髓涂片的染色
同血液涂片。
2
附
1
:<
/p>
【染色原理】
1
.瑞氏染料
是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。
美蓝
(又
名亚甲蓝
mehyleme blue
)
为四甲基
硫堇染料,通常为氯盐,即氯化美蓝。伊红(又名曙红
eosin
)通常为钠盐即伊红化钠。美蓝和伊红水
溶液混合
后产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀,即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后重新解离为
带正电的美蓝和带负电的伊红离子。
2
.细胞的染色
既有物理性的吸附作用又有化学的亲和作用,各种细胞和细胞的各种成分化学性质不同对各种染
料的亲和力也不一样,因此用染色液染色后在同一血片上可以看见不同的色彩。
例如:
?
血红蛋白嗜酸性颗粒为碱性蛋白,
与酸性染料伊红结合染成粉红色称为——
酸性物质
。
?
细胞核蛋白和淋巴
细胞浆为酸性,
与碱性染料美蓝或天青结合,
染蓝色或紫色称为
——
碱性物质
。
?
中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝
均可结合,染紫红色称为——
中性物质
。
3
.
PH
对细胞染色的影响
细胞各种成分均由蛋白质构成,由于蛋白质
系两性电解质,所带电荷随溶液
PH
而定,在偏酸性
环境中正电荷增多易与伊红结合染色偏红;在偏碱性环境中负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色
偏蓝,因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感,在染色过程中玻片必须清洁,配制瑞氏染液
必须用优质
甲醇,
稀释染液必须用缓冲液,
冲洗水应近中性,
否则各种细胞染色反应异常,
致使细胞的
识别困难,
甚至造成错误。
附
2
:
【血细胞发育
规律】
血细胞在分化成熟过程中,其形态和大小的变化基本上
有一个共同的规律:
1
.胞体:随着
血细胞的发育成熟,胞体由大逐渐变小,但巨核细胞系统则由小变大,原始粒细胞至
早幼
粒细胞也逐渐由小变大。
2
.胞核
(
1
)大小:由大变小,但红细胞系统例外,成熟红细胞核消失。
(
2
)形状
:圆形变为不规则形;粒细胞核呈分叶状;淋巴与浆细胞系统变化不大。
(
3
)染色质:细致、疏松逐渐变为粗糙、紧密。<
/p>
(
4
)核膜:
不明显变为明显;原淋巴细胞核膜最厚;原幼粒细胞核膜最薄;原始单核细胞介于两者
之
间。
(
5
)
核仁:由有至无。清楚的核仁是原始和比较原始细胞的重要标记,呈淡蓝色,随着细胞的成熟
而消失。
3
.胞浆
(
1
)量:有少到多。
(
2
)颜色:深蓝到浅蓝,见于淋巴细胞与浆细胞。红
细胞与粒细胞的胞浆各逐渐变成桔红和粉红色。
(
3
)颗粒:一般从无到少并逐渐增多。粒细胞系统由少量的嗜天青颗粒逐渐
代之以大量中性、嗜酸
和嗜碱颗粒。
(
4
)胞核与胞浆体积之比:由大到小。
3
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