-
细胞染色专题之一：台盼蓝
台盼蓝（
Trypan
Blue
，也称
Direct blue
14
）
：一种死细胞染色用色素
化学名：
3,3'-{[3,3'-
Dimethyl(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]bis(azo)}bis(5-a
min
o-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfoni
c
acid),
tetrasodium
salt3,3’
-
{[3,3’
-
二甲基
-
(1,1’
-
二苯基
)-
4,4’<
/p>
-
二基
]
双
(
偶氮
)}-
双<
/p>
(5-
氨
基
-4
-
羟基
-2,7-
萘二磺酸
)
，四钠盐分子式：
C34H24N6Na4O1
4S4
分子量
：
960.81
CAS Number
：
72-57-1
外观：
黑褐色结晶粉末
摩尔吸光度：
>69,000(
在
< br>606nm
附近
)
染色原理：
细胞损伤或死亡时，台盼
蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的
DNA
结合，使
其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以
鉴别死细胞与活细胞。
严格来
说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的
完整性，
通常认为细胞膜丧失完整性，即可
< br>认为细胞已经死亡。
这被称为染料排除测试
（
dye
exclusion
）
< br>，
Erythrosin
B(
红
色
)
、
ne
grosine
、
eosin Y
、<
/p>
AO
和
EB
也用
于此目的。通过显微镜很容易就能识
别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数
器进行计数。
溶于水，可以配制成
1
0mg/ml
的水溶液，水溶液呈深蓝色。
< br>台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时
,
细胞分离后的存活
情况，
用
0.4%
台盼
蓝直接染色
5-10
分钟，在显微镜下观察即可。
应用于细胞凋亡：
如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如
果细胞膜
完整，
细胞不为台盼蓝染色，
则为正常细胞或凋亡细胞。
尽管在凋亡的
早期到中期检测是很困难的，
此
方法对反映细胞膜的完整性，
区别坏死细胞有一
定的帮助。
储存条件：
常温保存
注意事项：
1.
台盼蓝对人体有毒
2.
台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。
3.
台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，
< br>还比较方便，
对贴壁细胞来说，
较为繁琐。
因为要消化，有时，
96
孔板不一定能消化干净。而
且，该法是测定细胞浓度的
方法，
与细胞悬液的体积有关，
加入的胰蛋白酶或
1640
要计入终体积。
可以说，
该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。
细胞染色专题之二：美蓝
美蓝
英文名：
Methylene
blue
，
Swiss blue
中
文名：
亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱
性亚甲天蓝等。
分子式：
C16H18ClN3S
分子量：
319.85 g/mol
CAS
Number
：
61-73-4
EINECS Number
：
200-515-2
熔点：
100
℃
沸点：
分解
吸收峰：
668nm
和
609nm
。
染色原理：
美蓝是一种无毒性的染料，
它的氧化型呈蓝色，
还原型无色。
用美蓝对酵母
活细胞染色时，由于细胞的
新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能
使
美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，
而对代谢作用微弱或死细胞，
无此还原
能力或还原能力极弱，
而被美蓝染
成蓝色或淡蓝色。
因此，
不仅用此法可观察酵
< br>母
细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
细胞染色专题之三：吖啶橙
吖啶橙：
N,N,N',N'-tetramethylacridi
ne-3,6-diamine
中文名：
3,6-
双
(
二甲基氨基
)
吖啶
英文名：
Acridine
Orange
（
AO
）
，
Euchrysine
，
3,6-Acridinediamine
，
< br>Waxoline
Orange
A
，
Acridine Orange
Base
，
Solvent Orange
15
，
Rhoduline
Orange
，
Rhoduline
Orange
N
，
Acridine
Orange
NO
，
Rhoduline
Orange
NO
，
Basic
< br>Orange
分子式：
C17H19N3
分子量：
265.35 g/mol
CAS
number
：
10127-02-3
外观：
橙色、红棕色粉末
染色原理：
吖啶橙（
AO
）与双链
DNA
形成发绿
色荧光的复合物。
AO
还可与单链
DA
N
或
RNA
形成发红色荧光
的复合物。
一个
AO<
/p>
分子嵌入双链
DNA
的三个碱基对并发出
最大波长为
526nm
（激发
502nm
）的绿色荧光。一个
AO
分子与单链
DNA
或
RN
A
的一个磷
酸基相互作用形成聚集或
堆叠的结构，此结构发出最大波长为
650nm
（激发
460nm
）的红色荧光。因此，
AO
用于被利用来检测双链
DNA
和单链
DNA
或
RNA
。它使
得用氩激光激发器或流式细胞仪同时测定
DNA
和
RNA
成为可能。
光谱数据：
与
DNA
作用时和荧光素相似，
激发最大波长
< br>502nm
，
发射最大
525n
m
（绿光）
。
于
RNA
作用时，
激发最大波长移动到
460nm
（蓝光）
，
发射最大移动到
650nm
（红
光）。
染色程序：
1.
用
PBS
或合适缓冲液制备
< br>10-50
μ
M
AO
溶液。
a)
2.
将
1/10
细胞培养基体积的
AO
溶液加入细胞培养基中。
b)
3. 37
℃下孵育细胞
10-20<
/p>
分钟。
4.
用
PBS
或合适缓冲液洗涤细胞
2
次。
5.
用带
有
500nm
激发和
530nm
发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a)
由于
AO
可能具有致癌性，因此操作过
程中须格外小心。
b)
可以用
1/10
浓度的
AO
缓冲液代替培养基。
储存条件：
避光
,
冷藏保存
细胞染色专题之四：碘化丙啶
碘化丙啶
英文名：
Propidium
iodide, Propidium diiodide; PI
分子式：
C27H34I2N4
分子量：
668.39
外观：
红棕色粉末
< br>应用：
DNA
染色
染色原理：
碘化丙啶
(PI)
是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链
DN
A
后释放红色荧
光。尽管
PI
不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
PI
经常
被用
来与
Calcein-AM
或者
FDA
等荧光化合物一起使用，
能同时对活细
胞和死细
胞染色。
光谱性质：
PI-DNA
复合物的激发
和发射波长分别为
535nm
和
615nm
。
染色过程：
1
．
用
PBS
或适当的缓冲液制备
10
～
50
μ
M
的
PI
溶液。
a)
2
．
将
1/10
培养基体积的
PI
溶液加入到细胞培养基中。
b)
3
．
在
37
℃培养细胞
10-20
分钟。
4
．
用
PBS
或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5
．
用
535nm
激发波长，
615nm
发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。
a)
由于
PI
可能具有致癌性，请小心操作。
b)
也可以用
1/10
浓度的
PI
缓冲液代替培养基。
保存条件：
4
℃避光保存
对人体有刺激性，请注意适当防护
细胞染色专题之五：罗丹明
123
罗
丹明
123
：
Rhodamine
123
分子式：
C21H17ClN2O3
分子量：
381
外观：
橙红色、红棕色固体
/
粉末
溶解性：
可溶于
DMSO
CAS
Number
：
62669-70-9
染色原理：
Rh
123
是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针，容易被有活性的线粒体
摄取，没有细胞毒性。
Rh123
透过细胞膜
在活细胞的线粒体内聚集，发出黄绿色
荧光，可用于对许多种细胞进行染色，包括植物细
胞和细菌。由于细胞内
ATP
的量与
R
h123
的荧光强度之间有相关性，此化合物被应用于检测细胞内的
ATP
。
Rh123
还用于癌症研
究。
光谱性质：
lexl em
(MeOH) = 505nm534nm. e (505 nm, MeOH) = 97,000.
染色步骤：
1.
将
0.4mg
Rh123
溶解到
1ml
DMSO
中制备成
1mM
Rh123-DMSO
溶液。
2.
用载玻片准备细胞。细胞数目应为
5×10e4
-
5×10e5
个
< br>/ml
。
3.
孵育该载玻片，用
PBS
或
Hank’s
液洗涤细胞。
4.
用培养基稀释
1mM Rh123
溶液
以制备
1-20
μ
M
Rh123
缓冲液。
5.
将
Rh123
缓冲液
a
)
加入载玻片并在
37
℃下孵育
30
分钟至
1
小时
。
6.
去除
Rh123
缓冲液并用培养基洗涤细胞。
b)
7.
用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a)
加入细胞前将
Rh123
缓冲液放在
37
℃下孵育。
< br>
b)
洗涤细胞后为了固定，加入
10
％福尔马林缓冲液并孵育
15-20
< br>分钟，接着用
PBS
洗涤。
储存条件：
避光冷藏保存
细胞染色专题之六：溴乙锭
溴乙锭：
Ethidium bromide
化学名：
溴化
3,8-
二氨基
-5-
乙基
-6-
苯基啡啶
英
文
< br>名
：
2,7-Diamino-10-ethyl-6-
phenylphenanthridinium
bromide
，
2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenylphenant
hridinium
3,8-Diamino-1-ethyl-6-phenylp
henantridinium
EB
，
EtBr
别名：
胡溴胺
;
溴乙胺菲啶
;
溴乙菲啶
分子式：
C21H20BrN3
分子量：
394.31 g/mol
CAS
number
：
1239-45-8
熔点：
260 - 262
℃（
from
wiki
）
性质：
bromide
bromide
，
，
3,8
-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridinium
bromide
，
Homidium
bromide
，
从酒精中结晶的是具
苦味的深红晶体，熔点
238
～
240
℃；
20
℃时溶于
20
份
水和
750
份氯仿。染色原理：
EB
不能穿过活细胞的细胞膜，
然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞
< br>核
DNA
染色。
EB
含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团
的固定位置及
其与碱基的密切接近，导致染料与
DNA
结合并呈现荧光，由于
EB-
DNA
复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产
率，
所以当电泳凝胶中含
有游离
EB
时，也可检测出少量
DNA
。它是一种高灵敏的荧光试剂，也是一种重
要的荧光染料，常用于检测
DNA
和
RNA
。
EB
与
DNA
结合后
抑制
DNA
的复
制和转
录。
光谱性质：
EB-DNA
复合物的激
发波长和发射波长分别为
518nm
和
605nm
。
染色过程：
1.
< br>用
PBS
或合适的缓冲液制备
1
0-50
μ
M
EB
溶液。
a)
2.
将
1/10
培养基体积的
E
B
溶液加入细胞培养基中。
b)
3.
37
℃下孵育细胞
10-20
分钟。<
/p>
4.
用
PB
S
或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5.
用带有
515nm
激发波长和
600nm
发射波长的滤光片的荧光显微
镜观察细胞。
a)
由于
EB
可能有致癌性，操作时须十分小心。
b)
可以用
1/10
浓度的
EB
缓冲液代替培养基。
储存条件：
避光
,
冷冻保存
细胞染色专题之七：曙红
Y
曙红：
Eosin Y
中文名：<
/p>
水溶伊红；四溴荧光黄；朝红；四溴荧光素钠；曙红钠盐；曙红
,
水溶
性；黄光曙红
英文名：
Eosine Yellowish
，
Bromoeosine
，
Tetrabromofluorescein
C.I.
name
：
Acid red 87
分子式：
C20H6O5Br4Na2
分子量：
691.9
性质：
以
AgNO3
滴定
B
r-
，
I-
，
SCN-
等时用作吸附指示剂。
CAS Number:
17372-87-1
MDL
number
：
MFCD00005040
Colour Index
Number
：
45380
光谱性质：
最大吸收
524.8
nm
；最大激发
490 nm
染色原理：