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组织病理切片的制作流程
1
.
取材
组织取材的方法是制作切片的一
个重要程序,根据教学、科研及外检的具体要求取自人体(外
科手术切除标本、活检标本
、尸检标本)或动物,并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖
学、组织学、病理
学的基本理论知识,还要掌握实际操作技术,每个组织器官的取材都有一定的部
位和方法
,不能任意切取组织作为制片材料,不然,无法达到教学、科研和临床诊断的目的,具体
要求如下:
(1)
材料新鲜:取材组
织愈新鲜愈好,人体组织一般在离体后,动物组织在处死后迅
速固定,以保证原有的形态
学结构。
(2)
组织块的大小:所取
组织块较理想的体积为
2.0cm×2.0cm×0.3cm,以使固定液
能迅速而均匀地渗入组织内部,但根据制片材料和目的不同,组织块的较理想体积也不
同,如制作病理外检、科研切片,其组织块可以薄取
0.1
~
0.2cm
即可,这样可以缩短
固定脱水透明的时间,若制作教学切片厚取
0.3
~
0.5cm
,这样可以同一蜡块制作出较
多的教
学切片。
(3)
勿挤压组织块
:
切取组织块用的刀剪要锋利,切割时不可来回锉动。夹取组织时
切勿过紧,以
免因挤压而使组织、细胞变形。
(4)
规范取材部位
:
要准确地按解剖部位取材,病理标本取材按照各病变部位、性质
的不同,根据
要求规范化取材。
(5)
选好组织块
的切面
:
根据各器官的组织结构,决定其切面的走向。纵切或横
切往
往是显示组织形态结构的关键,如长管状器官以横切为好。
(6)
保持材料的清洁
:
组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等,可用水冲洗
干净后再放入固
定液中。
(7)
保持组织的原有形态
:
新鲜组织固定后,或多或少会产生收缩现象,有时甚至完
p>
全变形。为此可将组织展平,以尽可能维持原形。
2
.固定
(
1)
小块组织固定法:这是最常用的方法,从人体或动物体取下的小块组织,须立即
p>
置入液态固定剂中进行固定,通常,标本与固定液的比例为
1:4<
/p>
~
20
,但组织块不宜过
大过厚,否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为
2.0cm×2.
0cm×0.3cm。
1
(2)
注射、灌注固定法:某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入
内部,或需要对
整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将
固定液注入血
管,经血管分支到达整个组织和全身,从而得到充分的固定。
(3)
蒸汽固定法:比较小而厚的标本,可采用锇
酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片,
则应在血片未干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。
最常用的固定液有
10%
甲醛固定液和
95%
乙醇固定液。
3
.脱水透明
标本经过固定
和冲洗后,组织中含有较多的水分,必须将组织块内的水
分置换出来,这一过程叫做脱水
。无论是用石蜡切片,还是用火棉胶切片,都必须除去
组织中所含水分,因含水组织与石
蜡、火棉胶等包埋材料不相容,常用的脱水剂为一系
列不同浓度的乙醇。
脱水的步骤是:
80%
、<
/p>
90%
、
95%
、
100%
各种浓度乙醇
2
小时,此过程可用脱水机自控
完成。
丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂,但因其脱水能力很强,对组织有剧烈收缩作
< br>用,在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。因乙醇、丙酮等不溶于石蜡,还要经过
一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、水杨酸
甲酯等。
4
.浸蜡、包埋
(1)
使石蜡浸入组织中,取代组织中含有的透明剂。
<
/p>
(2)
包埋:
将浸蜡后的组织置于融化的
固体石蜡中,
石蜡凝固后,
组织即被包在其中,
称蜡块,此过程称为包埋。
5
.切片和贴片
(1)
修整蜡块:可视其组织的大小,在组织边缘约
0.1
~
0.2cm
处,切去余蜡部分,
p>
否则易造成组织皱缩不平。
(2)
准备好切片用具:切片刀、毛笔、眼科镊子(弯)、漂烘温控仪
p>
(3)
安装蜡块:将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上。
(4)
安装切片刀:将切片刀安装在切片机
的刀台上,把刀台上的紧固螺丝旋紧,使切
片时不产生振动,能保持一定的切片厚度。<
/p>
(5)
切片的厚度:切片机的厚度调节
器上刻有
0
~
50
μ
m
或
0
~
25
μ
m
,
可任意选择其
厚度,石蜡切片的厚度一般在
4
< br>~
6
μ
m
。
(6)
切片
2
(7)
铺片:
用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在
40
~
45
℃的水面上,
借水的张力和水的温
度,将略皱的蜡带自然展平。
(8)
贴片、烘片:待切片在恒温水面上充分展平后,将蜡片捞到载玻片的中段处倾去
载玻
片上的余水,
置入
60
~
65
℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片
15
~
30
分钟,
脱去溶化组织间隙的石蜡。
6
.染色
和封片
常用的染色方法是苏木素
-
伊红
(
Hematoxylin-Eosin
)染色法,简称
H.E
染色法。这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的
切片均可使用。苏
木素是一种碱性染料
,
可使组织中的嗜碱性物质染成蓝色,如细胞核中的染色质等;伊
红是一种酸性染料,可
使组织中的嗜酸性物质染成红色,如多数细胞的胞质、核仁等在
H.E
< br>染色的切片中均呈红色。
H.E
染色程序如下
:
脱蜡、脱苯、复水、染色、脱水、透明、封固
常规苏木素染色中的对比染色是用伊红
,
近年来在英、美国家的一些实验室则采用焰红
(
phloxine
)
,
此
外也有用桔黄
G
(
OrangeG
p>
)、比布里希猩红
(Biebrich scarlet)
、波
尔多红
(Bordeaux
red)
等作为对比染色。伊红为染胞质、胶原纤维、肌纤维、嗜酸性颗
p>
粒等常用的染料。
1 .
取材
取材的好坏,直接影响切片的质
量。医生在取材时,首先要有一把锋利的取材刀,
在切割组织时要避免取材刀来回拖拉,
切取的组织块厚薄要均匀,一般厚度以
0.2
~
0.3cm
为适,较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌
组织等可适当
厚一点,而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易
渗入的组织
应取薄一些;淋巴结应修掉两侧球冠,并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中
还应十分
注意组织内是否有缝线或骨组织,如碰到不可避免的钙化组织,应与技术室讲明
,在切
取纤维组织、肌肉、组织、胃肠道时,应注意纤维及肌肉的走向,取材时尽可能按
与纤
维平行走向切取为佳。
2 .
固定
固定是技术室工作的第一步,<
/p>
也是在整个制片过程中无法补救的一步。
所谓
“固定”
,
就是组织离体后,
用各
种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位
置的过程。固定的目的是
为了防止组织细胞自溶与腐败,防止了细胞内的酶对蛋白质的
分解作用,
使细胞内的各和成分如蛋白质、
脂肪、
碳水化合物或酶
类转变为不溶性物质,
以保持原有的结构与生活时相仿。另外,组织固定后,均呈一定的
硬化状态,增加组织
3
韧性,而且
不易变形,有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定,固定
液的量应为组
织的
5
倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固
定液的浓
度、固定的温度和时间有关。最常用的固定液为
10<
/p>
%福尔马林。笔者认为,
10
%福尔马<
/p>
林由于受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入的水分影响,浓度被降低致组
p>
织固定不足,而高浓度的福尔马林,降低了对组织的穿透性,形成周围固定好而中央固
定不到的现象。
通过实践,
本人认为以酸性<
/p>
12
~
15
%的
福尔马林最佳。
大标本
(
2cm
厚)
一般需要
6
~<
/p>
12
个小时,小标本一般需要
3
~
6
个小时;当室温低
18
℃时,可在
37
℃以
下的温箱内加温
4
~
6
p>
个小时。由于
HE
染色最佳着色
PH
为
3.5
~
4.5,
中性福尔马林对
苏木素染色有一定影
响
,
细胞核容易发灰
,
核染色质不佳。
所以
,
尽管
中性福尔马林对抗
原有很好的保存作用,但酸性福尔马林对绝大多数抗原来说也有很好的
保存作用,所以
在没有特别处理的情况下常规
HE
用
12
~
15
%酸性福尔马林也可以
(每
100
< br>毫升
12
~
15
%
福尔马林液内加
5
毫升冰醋
酸)
。骨髓、结缔组织固定以
Bouin
液为佳,经
Bouin
液固
定后的组
织必须流水冲洗
4
小时以上。
有条件的
单位可根据不同要求选用二种或二种以
上的固定液;少数单位还可建立组织冷冻库,以便
适应各种特殊的处理要求。
3.
水洗
固定后水洗(
< br>10
~
20
分钟)
,通常被很多人所忽视,而水洗不彻底,
容易造成脱片和
染色不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织,更不应当忽视。福尔马林不利于组织块内抗
原的保存
4 .
脱水和透明
所谓脱水就是利用脱水剂
将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入,这一
过程称为脱水。脱水是否彻底,
直接关系到组织是否能充分透明,而脱水过度(原因是
组织在纯酒精内时间过久,发生组
织质地发生变化)容易造成组织发脆。造成组织发脆
的原因还有加温(温度超过
35
℃)
、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中
二甲苯过多等
等。一般我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关,而忽视了与低浓度的酒精
关系,其实
低浓度的酒精具有强大的穿透力,比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水
,组织如
果在低浓度酒精里充分脱水,在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的
水份,
因此,仅需短时间就可完成,如果这时不缩短纯酒精的时间,便会引起组织发脆;
如果
脱水时加温,使用丙酮,还可引起组织收缩,并影响免疫组织化学的标记。为了使石
蜡
浸入到组织块内,必须经过一种既能与脱水剂混合,又能与石蜡相溶的媒介物质,这个
过程称透明。目前最好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆,这个<
/p>
4
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