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实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法
一、爬片前盖玻片处理方法
对于悬浮
培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细
胞在长时间的染色过程中
不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在
载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的
物质是经常采用的方法之一。能促进细胞
黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这
里介绍多聚赖氨酸的涂布方
法。
1<
/p>
、将载玻片用玻璃专用洗涤剂
(
如
Decon)
浸泡
5min
< br>，间或振荡。
2
、用自来水冲
洗
5min
。
3
、以
1
％盐酸
—
70
％乙醇溶液浸泡
5min<
/p>
。
4
、烤箱干
燥
(
至此即可用于普通染色
)
。
5
、多聚
L-
赖氨酸
(1:10
溶于去离子水
)
浸泡
5min
，振荡。
6
、入
60
℃烤箱
1 h
，或室温过夜干燥
(
用于细胞化学、免疫细胞化学及原
位杂交细胞化学
)
。
二、细胞固定常用方法
固定细胞的目
的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避
免组织和细胞发生降解、自溶
、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去
活性，防止细胞和组织的各种分子变性、
解离，使细胞的化学物质和酶能准确
定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和
破坏。同时，固定还可使
细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。
1.
固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用
新鲜培养物；根据检测工具、
对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。
2.
培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，
如双盖片悬滴培养物、
悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双
盖片悬滴培
养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，
PB
S
漂洗
2
～
3
次后，备固定制
片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿
中取出后，
PBS
液漂洗
2
～
3
次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备
固定用。
3.
常用固定液：常用的固
定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定
液，称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、
甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味
酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇
(
锇酸
)
。另一类
是用两种或
两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如
Mueller
固定液、
Flemming
< br>固液、
FAA
固定液、
Car
noy
固定液、
Rossman
固定液
、
Altmann
固定
液、
Bouing
固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构
固定
效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。
(1)4
％甲醛
-PBS:
甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含
40
％甲醛。在
很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。
4
％甲醛
-PBS
使组织变硬速
度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定
< br>材料可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，
能增
强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和
高尔基体的固定
液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用
40
％甲
醛水溶液
:PBS=1:9
配方制备甲
醛固定液。
(2)
丙酮：丙酮为无色
易挥发液体，用纯冷丙酮
(4
℃
)
固定细胞内酶效果较
佳。
(3)
乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细<
/p>
胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好
固定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的
适宜浓度为
70
％～
100
％。乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。
(
4)
醋酸：常用
0.3
％～
5
％浓度的醋酸作固定剂。醋酸能和水及乙醇、甲醇
溶合，醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸。醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨
胀作用显
著，这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合，所以，常用醋酸来减
少其他固定剂引起的
细胞收缩。细胞学技术中，它能防止细胞收缩，并能较好
地保存染色体，还能把染色质沉
淀成为可染色的块状体。
(5)
苦味
酸：苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯，
在水中的溶解度可因水
温变化而变化。苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋
白、组蛋白和核酸。苦味酸的穿透
力很慢，单独使用时，造成组织严重收缩。
它和其他药物混合配制时，可以作为蛋白质的
沉淀剂，同时可避免组织收缩、
硬化，而且易于染色。所以在很多混合固定液中被广泛采
用。作固定用的最适
浓度为
1
％。
(6)
锇酸
(<
/p>
四氧化锇
)
：锇酸是一种强氧化剂，不能
同乙醇和甲醛混合使用。
它的挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，
所以操作时应
特别注意。四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一，配制时先在棕色试
剂
瓶中盛入
50
～
100ml 0.1mol/L
磷酸缓冲液
(pH7.0<
/p>
～
7.4)
，再将装有
< br>1g
锇酸的安
培瓶放人
PBS<
/p>
中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使锇酸溶解，备用。常用的固定液
浓
度为
1
％～
2
％。
(7)
戊二醛：戊二醛对组织的
渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋
白质，对微管和膜性结构保存亦比较好，并
能较好地保存糖原。常用的戊二醛
固定液配制方法列于表
12-
1
。
表
12-1
常用的戊二醛固定液配制方法
Ph7
.2
的
0.1mol/L
磷酸缓冲液（
ml
）
96
96
25%
戊二醛水溶液（
ml
）
4
戊二醛的终浓度
1%
(8)
甲醇／醋酸固定液：甲醇：醋
酸为
3:1
的固定液是应用最广的一种培养
细胞固定剂。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞
形态不
变。不仅最适用于固定染色体，而且固定的染色体适于
Giemsa
染色
(
注
意：此固定液宜现用现配
)
。
(9)
FAA
固定液：此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞，固定效果好。
配制方法：
90ml 80
％酒精中加
5ml
冰乙酸和
5m140
％甲醛。
(10)Carnoy
固定液：
Carnoy
固定液是较好的非水
溶性固定液，是显示细胞
化学成分
(
如
粘多糖等
)
时常用的固定剂，固定、保真效果好，但穿透力差，
适
于固定培养的单层细胞。配制方法：
60ml
纯酒精加
30ml
氯仿和
10
ml
冰乙酸。
(11)Bouin<
/p>
固定液：用于固定双盖片法培养的标本，固定
30
分钟后，用
70
％酒精褪去苦味酸黄色，如不立即染色
，可将标本保存在
70
％酒精中。本试剂
适于固定组织细胞的糖原。配制方法：先将
75ml
饱和苦味
酸
(100ml
水中加
1.2
～
1.4g)
过滤，加入
25ml
福尔马林
(40
％甲醛，有
沉淀时禁用
)
，最后加入
5ml
冰
醋酸，混和后存于
4
℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。该固定液对组
6
1.5%
92
8
2%
90
10
2.5%
88
12
3%
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