-
大肠杆菌重组人干扰素
α
-2b
的发酵
作者：丁少云
指导老师：江
诚
(
安徽医
学高等专科学校，安徽合肥，
231000)
摘要：
目的
:
探索获得大肠杆菌的高密度发
酵和高效表达分泌型重组人干扰素
α
-2b
的方法。
方法
:
通过
小试研究获得大肠杆菌分泌型重组人干扰素
α
-2b
发酵的基本条件
;
< br>通过中试研究碳源、氮源等营养物质
补加的方式
;
同时就单独补充碳源、
分别补充碳源和氮源的两种不同的发酵方式进行
对比分析。
结果
:
经优
化后的发酵条件
,
最终菌体的光密度可达
A
600
= 70,
分泌型重组人干扰素
α
-2b
终产品为
120
g
·
L
-
1
菌
体
,
平
均比活性为
2.2
×
10
8
IU
·
m
g
-
1
蛋白
。
结论
:
获得了较满意的高密度发酵条件和重组人
IFN
α
-2b
的
高表达条件。
关键词
：重组人干扰素
α
-2b;
大肠杆菌
;
发酵
1.
引言
干扰素
α
-2b
(interferon
α
-2b,
IFN
α
-2b)
是由
165
个氨基酸组成的单链多肽
,
理论
分子量为
19219,
由两对二硫键构成
,
有一定空间结构
,
其中
29-138
位的二硫键对于维持活
性尤其重要
[ 1 ]
。干扰素是最早通过基因工程技术表达的蛋白质之一。
利用传统的胞内表达
方法有一定的缺陷
,
如蛋白始终以还原状态存在
,
无法形
成正确的三级结构。
本课题组利用
分泌型表达技术构建的
IFN
α
-2b
工程
菌
,
使所表达的外源蛋白直接分泌于细菌的细胞间质中
,
有利于蛋白质纯化
;
同时
,
所表达的蛋白同天然
IFN
α
-2b
有相同
的一、
二、
三级结构
,
因此
有
100%
的生物学活
性。本实验研究了大肠杆菌重组人
IFN
α
-2b
的发酵工艺
,
对比单独补充
碳
源、
同时补充碳源和氮源的两种不同方式的发酵方法
,
获得了较满意的高密度发酵条件和重
组人<
/p>
IFN
α
-2b
的高表达条件。
2.
材料与方法
2.1
菌
种
工程菌为
E .coli JM 101,
基因型
F -m crA m crB IN (rrnD
-rrnE ) lam da,
来自
A T
C
C
;IFN
α
-2b
cD
N
A
来自安徽农业大学免疫学教研室
;
用于构建表达质粒的起始质粒
P
S
T
Ⅱ其结构包括碱性磷酸酶启动子
(phoAprom oter
)
、翻译增强子序列、
SD
序列、
S T
Ⅱ信
号肽序列、
A m p
及
T
et
抗性基因、复制起点。
2.2
发酵罐
B .B raun 5
L
发酵罐、
A pplican 40
L
发酵罐。
2.3
培养基
①种子培养基
: L B
培养基
;
②筛选培养基
(g
·
L
- 1
):
葡萄糖
2
g
、酵母粉
1.2
g
、蛋
白胨
15
g
、
N aC l 1.2 g
、
N H
4
C l 0.96 g
、
M gSO
4
·
7H
2
O0.494
g
、调
pH
至
7.5;
③
发酵基本培养基
< br>(g
·
10 L
- 1
) N aH
2
P O
4
·
2H
2
O 8.5
g
、
K
2
H P O
4
·
3H
2
O
22.3 g
、
(N H
4
)
2
SO
4
42
g
、
M gSO
4
·
7H
2
O12 g
、葡萄糖
10
g
、酵母粉
50
g
、蛋白胨
36
g
、柠檬
酸三钠
9.65 g,
微量元素
5 m L
。其中微量元素混合物成分
: F
e
、
C
o
、
M
o
、
Zn
、
C u
、
M
n
、
B
等
;
④补料
:a. 50%
葡萄糖
(105
℃灭菌
20 m in );b .
蛋白胨
45
g,
酵母粉
14 g,
溶解
于
1
L
水中
;
c.
采用单独流加葡萄糖方法
,
需在每升发酵基本培养基中另加入蛋白胨
4.5
g,
酵母粉
1.4
g
。使用发酵罐培养时
,
不应加入任何抗生素。
2.4
检测方法
通过
SDS -P A G E
电泳
,
并经
V D S
扫描仪分析
IFN
α
-2b
的表达量
;
通过尿糖检测试剂
盒检测发酵培养
过程中糖的变化
;
中试发酵结果的研究采用低渗裂解方法
,
并通过
SDS -P A
G E
电泳法检测蛋白量
;
对
40L
发酵罐中试结果的分析
,
均采用统一的纯化工艺路线
;
终产
品检测方法及质量标准符合《中国药品生物制品检定规程》
(2000
版
)
有关规定。
2.5
大肠杆菌重组人
IFN
α
-2
b
发酵基本条件
发酵基本条件的摸索采用摇瓶完成
,
通过
SDS -P A G E
检测<
/p>
IFN
α
-2b
表达量来决定发酵
基本条件的优劣。
小试实验条件相同
:
划
L
B
平板
(
含
Tet,3
7
℃培养过夜
),
挑取单克隆
,
接
种于
10 ml
< br>液体培养基中
(
含
Tet)
。
37
℃培养至
A
600
在
1.5
左右
,
分别进行下面的不同实验
,
每组实验均采用筛选培养基
,
接种量均为
5% ,
摇床转速
220
r
·
min
- 1
。
2.6
发酵培养周期
通过分泌型表达技术构建的工程菌
,
结构中包括碱性磷酸酶启动子
(phoAprom
oter),
其特点是随着培养基中磷酸盐的逐渐消耗
,
出现低磷酸盐条件时
,
开始诱导表达
分泌
IFN
α
-2b
< br>。采用
5
L
发酵罐和发酵培养基
,
采用单流加葡萄糖补料
,
并控制比生
长速率。在
37
℃、
pH
7.0
、保持溶解氧不低于
30%
的发酵培养条件下
,
确定
IFN
α
-2b
工程菌的
发酵周期。
2.7
中试发酵工艺研究
中试发酵工艺是在
5
L
发酵罐结果基础上进行线性放大
,
采用
40
L
发酵罐进行研究。既
往关于采用流加补料的形式获得相对高密度的发酵结果的研究已经
很多
,
故未将其列入
,
而重点研究单补糖及补糖、补氮结合的流加方式的比较。将发酵工程菌划种
L
B
平板
,
37
℃
培养过夜
,
挑单菌落
,
接种于
10ml L B
(
含
Tet)
的三角瓶中
,
37
℃培养至
A
600
= 1.0,
再在
摇瓶中
(
含
Tet)
放大培养至
A
600
=
2.0,
作为种子液。
按
5%
接种量接种于发酵培养基中
,
进行
中试发酵。
①连续
流加葡萄糖方法补料
:
控制罐压小于
0.2
bar;
调节搅拌速度为
200
～
< br>1000
r
·
min
-
1
;
通气量始终保持溶解氧在
30%
以上
;
通过流加氨水控制
pH = 7.0;
通过糖检测试
剂盒检测发酵罐中葡萄糖含量。当罐中原有葡萄糖被耗尽时
,
开始以
2.5
g
·
L
-
1
·
h
- 1
的
速度补充葡萄糖
,
并逐步增加到
8.5
g
·
L
-
1
·
h
- 1
,
此后一直保持在
5
g
·
L
-
1
·
h
- 1
直
至发酵终止。②连续流加葡萄糖及氮源方法补料
:
补糖及检测方式同连续流加葡萄糖方法
,
同时流加补料
c,
进入稳定期前
,
补料
c
的流速为补糖流速的
1/2,
进入稳定期后
,
流速与
补糖流速一致。
3.
结果
3.1
发酵基本条件的确定
①
温度对发酵结果的影响
:
取
50ml
摇瓶
(
带机制档板
),
分别加入
10ml
表达培养基
,
接
入种子液
,
分别放置于
28
℃
, 33
℃及
37
℃培养
(
图
1),
说明发酵最适温度为
37
℃
;
②溶解氧
对发酵结果的影响
:
分别采用普通摇瓶及特
制内部带有挡板的摇瓶对工程菌进行培养及诱
导表达
(
特制内部带有挡板的摇瓶在同样转速下比普通摇瓶能提供更好的溶解氧
,
图
2),
表
明高溶解氧有利于目标蛋白表达
;
③
pH
值对发酵结果的影响
:
取
50ml
摇瓶
(
带机制档板
),
分别加入
10ml
表达培养基
,
接入种子液
,
培养基起始
pH
值分别为
6.0
、
7.0
和
8.0
(
图
3),
表明发酵最适
pH
值为
7.0
。
根据上述结果
,
本研究确定
IFN
α
< br>-2b
发酵的基本条件
:
温度
37
℃
,
pH 7.0
左右
,
保持较高的溶解氧
,
有利于目的蛋白的表达及分泌。
3.2
发酵培养周期
根据摇瓶实验的结果
,
结合发酵其他分泌型工程菌
的经验
,
本研究确定的
IFN
α
-2b
的
发酵基
本条件
:
温度
37
℃
, pH 6.5
～
7.5,<
/p>
溶解氧不低于
30%
。在发酵过程中
,
定时取样
,
通
过镜检监控大肠杆菌生长情况
;
通过
SDS -P A G E
结果来确定表达开始时间及表达量
,
初步
确定
IFN
α
-2b
的发酵周期为
22 h,
结果见图
4
。
3.3
中试发酵工艺
通过控制碳
(C)
源、
氮
(N)
源的流加速度
,
很容易控制比生长速率
,
减少有机酸的积累
,
-
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