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毕赤酵母发酵手册
总览
简介：
毕
赤酵母和酿酒酵母很相似，
都非常适合发酵生长。
毕赤酵母在有
可能提高总体
的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，
我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的
指导的人参与发酵。
因
为发酵的类型很多，所以我们很难为您的
个人案例提高详细的过程。下面
+s
两种
基因型的毕赤酵母菌株在
15L
的台式玻璃所给出的指导是基
于
MutMut
和发酵罐
中发酵而成。
请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。
下面所给出的表就是整
个
指导的概况。
步骤
标题
页码
发酵参数
1
1
设备推荐和培养基的制备
2
2
培养中溶氧的测量和使用
3
3
种子液的培养
4
4
在分批和分批补料培养中生物量对应于
5
4-5
甘油的生成
+s
基因型重组子在甲醇分批补和
MutMut
6
6-7
料状态下表达的介绍
细胞的成熟与衰退
7
8
参考文献
8
9-10
配方
9
11
发酵参数：
在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。
下面的表格描述了这些参数和
监测这些参数的原因。
参数
原因
温度
（
30
℃）
溶氧（＞
20
％）
在
32
℃以上的温度下生长不利于蛋白质的表达
毕赤酵母利用甘油和甲醇需要氧气
pH
（
5.0-6.0
和
3.0
）
对于外源蛋白分泌到培养基中和最适生长非常重要
转度
）
（
500-1500rpm
使培养基中的氧浓度达到最大值
<
/p>
通气（玻璃发酵罐
使培养基中的氧浓度达到最大值取决于容器
※
）
中为
0.1-1.0vvm
消泡剂（消除泡沫
过多的泡沫会引起分泌蛋白质的降低和罐顶空间的减少
的最小量）
碳源（变化率）
在发酵过程中要以不同的速率添加不同的碳源
※
）
L
）中氧气的体积（
L
体积发酵液（
1
每分钟
设备推荐：
下面是所推荐设备的清单：
·发酵罐的夹套需要在发酵过程中
给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程
中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（
5-10
℃）
。这可能意味着你需要一个
冷冻装置来保持水的冷却。
·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。
·一个氧气的来源——空气（不锈
钢的发酵罐需要
1-2vvm
）或者纯氧（玻
< br>璃发酵罐需要
0.1-0.3vvm
）
< br>。
·添加甘油和甲醇的补料泵。
·
pH
的自
动控制。
培养基的准备：
你需要准确配置下列溶液：
·发酵所需的基本盐类（第
11
页）
·
PTM
补
充盐类（第
11
页）
1
·
75m
l
的
50
％的甘油每升初始发酵
液，
12ml
的
PT
M
补充盐每升甘油。
1
·
740
ml
的
100
％的甲醇每升初始发
酵液，
12ml
的
PTM
补充盐每升甲醇。
1
毕赤酵母生长的测定：
在不同的时间点通过测
OD600
的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母
的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定：
简介：
溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，
溶氧
100
％是指培养基中氧达到
饱和。
毕赤酵母的生长需要消耗氧气，
减少溶解氧的满度。
毕赤酵母在生长时会
消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧
气，所以将
溶氧浓度维持在一个适当的水平
（＞
20
％）
来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至
关重要。
准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和
健康程
度之类的重要信息。
因此，
精确
校正您的发酵设备非常重要，
请查阅您的操作手
册。
溶氧浓度的维持：
1
、很难依靠发酵罐的氧气转换速率
（
OTR
）将溶氧浓度维持在
20
％，特别是在
小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为
0.1-0.3vvm
（
1L
发酵液每分
钟
1L
氧气）来
提供氧气使
DO
保持在
20
％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲
醇的总量和蛋白质的表达。
2
、在通气为
0.1-0.3vvm
时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发
酵罐中可
以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加
< br>OTR
（与
Ka
L
有
关）
。
3
、如果一个发酵罐不能提供足够水
平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。
请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水
平的降低。
4
、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添
加相似
水平的甲醇。
对许多重组蛋白质来说，
可以观察到甲醇消耗的总
量和蛋白
质产生的总量有直接的关系。
DO
测量的用处：
在毕赤酵母生长阶段，
消耗氧气而使
DO
浓度维持在较低水平。
请注意不管
是在
甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。
DO
< br>浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受
抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指
标。如果你希望能够完全的诱导
AOX1
启动子，确定碳源是否
受抑制就非常重要。例如：
DO
浓度的改变可让你
确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，
其次还可以确定甲醇流加的速率
是
否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞
1-2
< br>％
vvm
）可能会产生毒害。
DO
的调控：
如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的
速率降低，
DO
值
会上升。
终止碳源的添加，
观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使
DO
值上
升
10
％。如果延迟时间很短（＜
1min
）
，说明碳源受抑制。
发酵的准备和甘油批式发酵
发酵种子液的摇瓶培养：
记住不要向摇瓶中加入太多的培养基，培养基体积应该在摇瓶
总体积的
10-30
％
左右。
1
、
摇瓶中
包含约为初始发酵液体积
5-10
％的从
MD
或
MGY
平板上的一个菌落
或者冷冻甘油储藏液中接种的
MGY
或
BMGY
。
2
、
摇瓶应
该
30
℃，
250-300rpm
的摇床上培养
16-24h
直到
OD=2-6
。
600
为
了精
确的测量
OD
＞
< br>1.0
，在读数前将样液稀释
10
倍。
600
甘油批式发酵：
1
、将发酵罐和包含
4
％甘油的发酵基础盐类培养基灭菌。
2
、在灭菌和冷却后，待温度降至<
/p>
30
℃时，开启搅拌和通气至操作环境（通常为
< br>最大转速和
0.1-1.0vvm
）
并用
28
％的氨水
（未稀释）
将培养基的
pH
调整到
5.0
。
每升培养基中加入
4.3
5ml
无菌的
PTM1
基础盐类。
3
、从种子液
摇瓶中接种初试发酵体积
5-10
％的种子液到发酵罐内。请注
意在培
养开始先
DO
值接近于
100
％。当开始培养后会消耗氧气，导致
DO
值下降。请
添加所需氧气以确保
DO<
/p>
值超过
20
％。
4
、进行批式发酵直到甘油被完全消
耗（
18-24h
）
，标志是
DO
值增加到
100
％
。
请注意甘油完全消耗的时间会随着初试发酵液密度而变化。
5
、
每个发
酵阶段的完成都需要进行取样，
并且每天至少两次。
每个时间点
取
10ml
样品，并从
10ml
中另取出
1ml
样品。样品用于分析细胞的生
长（
OD600
和细胞
湿重）
，
pH
，显微观察，蛋白质的浓度或活性。将菌
体和上清（离心后）在
-80
℃
下保藏
，用于后面的分析。再进行第
5
页的甘油补料培养。
产量：
这个阶段所期望达到的细胞产量为
9
0-150g/L
湿细胞。重组蛋白质由于缺乏甲醇
的诱导而不
会产生。
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