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分子标记技术的类型及其原理
08
农生
1
班
陈耀光
2
所谓分子标记就是基于基因组
DNA
存在极其丰富的多态性而发展的一类可以直接
反映生物个体间
D
NA
水平上差异的新型的遗传标记方法。
在遗传学发展过程中
,
先后出
现了形态学标记、
细胞学标记
、
生化标记和分子标记,
其中以分子标记最为理想、
可靠,
因为
DNA
分子中
碱基的缺失、插入、易位、倒位或是长短与排列不一的重复序列等产生
的差异,
都可以通过分子标记进行检测。
DNA
分子标
记较以往的形态标记其优越性表现
在:
(1)
< br>以核酸为研究对象,不受季节、环境限制,不存在基因表达与否的问题,也没
有组
织或器官特异性;
(2)
数量的丰富性,遍及整个基因组,标记
的数量几乎是无限的;
(3)
多态性高,自然存在丰富的等位变
异;
(4)
许多标记表现为共显性,能很好地鉴别纯
合基因型与杂合基因型;
(5)
检测手段简便、快
速,并且重复性好;
(6)
既不对目标形状
的表达造成影响,也不会与不良性状之间产生必然的关联。
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分子标记的类型及其原理
分子标记技术自诞生以来,
短短的几十年时间中得到突飞猛进的发展,
至今被发展
和利用的分子标记技术已有二十余种,
为不同研究领域提供了有效的技术手段,
同时也
发挥
着至关重要的作用。目前,根据对
DNA
多态性检测手段和所
应用序列范围的不同,
对部分分子标记技术分类如下。
1.1
基于全基因序列的分子标记
RFLP
(restriction
fragment
length
polymorphism,
< br>限制性片段长度多态性
)
:
RF
LP
作为最早发展的分子标记技术由
Grozdicker
等于
1974
年创建,并由
Bostein
等再次
提出。
RFLP
技术的出现开创了直接在
DNA
水平
上进行遗传研究的新时代。其基本原理
是:
基因组
DNA
中限制性内切酶所识别的序列由于出现碱基变化而致使酶切位点的数量
也变化,
从而使酶切片段长短发生差异产生长度多态性。
利用特定的限制性内切酶切割
不同个体的基因组
DNA
,
由于不同个体中酶切位点的差别就得到了长短相异的
片段
DNA
,
电泳分离后,
借助
Southern
杂交将
DNA
片段转移至硝酸纤维素
膜上,
将具有放射性标
记的探针与膜上的片段杂交,
通过放射自显影技术就可以获得显示物种特异性的多态性
图谱。
RFLP
标记的等位基因是共显性的,能区分纯合基因型和杂合基因型,
结果稳定
可靠,重复性好,适合于连锁图谱的建立。但是对
DN
A
要求较高,检测步骤多,操作复
杂,
耗时费资,
而且需要放射性同位素等,
这都在很大程度上限制
了
RFLP
技术的应用。
RAPD (randomly amplified polymorphic DN
A,
随
机扩
增多态
性
DNA)
:
1990
年
Williams
等
(1990)
与
Welsh
和
McClelland
(1990
)
两个研究小组分别提出
RAPD
标
记技
术,
该技术是建立在
PCR
p>
基础上,
对未知序列的全基因组进行多态性分析的一种新型分
子标记技术。
其基本原理是利用一个人工合成的随机寡核苷酸
(
一般为
8~10
b
p)
为引物,
通过
PCR
对基因组
DNA
进行体外扩增,产生大小不同的
DNA
片段,再经凝胶电泳分析
扩增产物呈现
DNA
片段的多态性。与
RFLP
相比,
RAPD
技术的优点是技术简
单,检测
迅速,安全性好,
DNA
用量少,设计引物不需知道序列信息等,但
RAPD
标记为显性遗
传,不能区分纯合基因型与杂合基因型,且易受多种因素影
响,结果的稳定性和重复性
难以保证。
AFLP (amplification fragment length pol
ymorphism,
扩增片段长度多态性;又
称选择性限制片
段扩增:
AFLP
技术是
1993
年由荷兰科学家
Zabeau
等创建的
一种将限
制性酶切和
PCR
技术相结合的检测
DNA
多态性的分
子标记方法。
其实质是对基因组
DNA
限制性酶切片段进行选择性扩增,
具体过程为基因组
DNA
经两种或两种以上的限制性内
切酶酶切,产生大小不等的随机片
段,将人工双链接头连接到这些片段的末端,从而作
为扩增反应的模板,
再根据接头的序列和酶切位点设计引物实现选择性
PCR
扩增。
AFLP
技术可以说是集
RFLP
和
RAPD
技术与一身,
兼备两者的优点,
既有
RFLP
的可靠性,
又
具有
RAPD
的高效性,且重复性好,是一种十分理想的遗传标记,但与此同时也给试验
带来了昂贵的费用和复杂的操作过程,尽管如此,该技术依然在遗传多样性研究、遗传
图谱的构建、
基因定位和品质鉴定等方面已得到广泛的应用,
< br>经过人们近年来不断地改
进和完善,
AFPL
被认为是迄今为止最有效的分子标记。
1.2
基于简单重复序列的分子标记
SSR (simple sequence repeat,
简单序列重复
,
又称微卫星
DNA)
:一般是指基因
组中存在的由
2~6
个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。
这种
序列广泛分布于真核生物基因组,含量丰富,且随机均匀分
布,其重复次数的不同产生
了等位基因之间的多态性。
微卫星由
核心序列和两侧的保守侧翼序列构成,
可以根据
SSR
两侧的保守序列设计引物进行
PCR
扩增,由于不同品种
SSR
基序的重复次数不同,导
致
PCR <
/p>
扩
增
条
带
差
异
性
,
即
简
单
重
复
序
列
长
度
多
态
性
(simple
sequencelength
polymorphism,
SSLP)
。
SSR
标记具有以下优
点:表现多为共显性遗传,遵循孟德尔遗
传法则;数量丰富,广泛分布于整个基因组;对
DNA
数量及纯度要求不高,易于利用
PCR
检测;实验操作简便,结果稳定,重复性强。然而,
SSR
引物具有高度的种属特异
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