-
Oligo
—引物设计软件电子教程(引物设计和评估)
Oligo
使用方法介绍作为目前最好、最专业的引
物设计软件,
Oligo
的功能很强,
在这里我们介绍它的一些主要功能:如:普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交
探针
的设计以及评估引物对质量等等。
< br>在正式进行引物设计前,我们首先面临的一个任务就是向
Oligo
程序导入模板序
列,根据不同的实验情况,导入模板有三种方法:
1.
直接用键盘输入:
a.
点击
file
菜单中的
New
Sequence
浮动命令,或直接点击工具栏中的
New
Sequence
命令,进入序列展示窗口;
b.
此时即可键入
DNA
序列;
c.
如果需要的话,
Oligo
提供碱基回放功能,在边键入时边读出碱基,防止输入错误。
点击
Edit
菜单中的“Readba
ck on”即可。
2.
利用复制和
粘贴:
当我们序列已经作为
TXT
文件
存在或其它
oligo
不能直接
ope
n
的
文件格式,如
word
文件
.html
格式,这个功能就显得很有用了。
在相应文件中复制序
列后在序列展示窗口粘贴,
oligo
p>
会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后,
点击
Accept/Discard
菜单中的
Acce
pt
浮动命令,即可进入引物设计模式。
3
,如果序列已经保存为
Seq
格
式或者
FASTA
,
GenBank<
/p>
格式时,
oligo
就可以直接打
开序列文件。
点击
File
菜单中的“Open”浮动命令,找到所需文件,打开即可。
< br>
进入引物设计模式后,
oligo
一般会弹出三个窗口,分别是
6
-碱基频率窗口,碱基退<
/p>
火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口,其中的退火温度窗口是我们引物设计的主
窗口,其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用,比如
6
-碱基频率窗口可以使我
们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的
出现频率,如果我们的模板是基因
组
DNA
或混合
DNA
时,
该信息就显得有
用了,
而内部稳定性窗口则可以显示引物的
5’
端稳定性是否稍高于
3’端等。
一,普通引物对的搜索:
以
Mouse 4E
(
cDNA
序列)为例。我们的目的是以
Mouse
4E
(
2361 bp
)为模板,设计
一对引物来扩增出
600
-
800bp
长的
PCR
产
物。
1.
点击“Search“菜单中的”For Primers
and Probes“命令
.
进入引物搜索对话框;
2.
由于我们要设计的是一对
PCR
引物
.
因此正、负链的
复选框都要选上
.
同时选上
Compa
tible pairs
。
在
Oligo
默认的状态下
.
< br>对此引物对的要求有:
a.
无二聚体;
< br>b.
3’端高度特异
.GC
含<
/p>
量有限定
.d.
去除错误引发引物等。<
/p>
3.
剩下的工作是确定上、下游引物的
位置及
PCR
产物的长度以及引物设计参数。
< br>
①单击:“search
Ranges”按钮
.
弹出“Search
Ranges”对话
框。输入上游引物的范
围:
1
-
2000.
下游引物的位置:
100
-
2300
;
PCR<
/p>
产物的长度
600
-
800bp
。
②单击“Paramaters”按钮进入“Search Parameters”对
话框
.
对话框种分三个活
页
.
分别是:不同设定
.
参
数以及更多参数。
③在“普通设定”窗口
.
为我们提供了对引物非常直观的设定方法
.
从高到低分六个等
级
.
最后
还有一个用户定制选项。
④当我们对引物的各种参数的含义及
应该设定多大值并不是特别清楚时
.
就可以直接
设定
Very
high/High
等来完成对引物设计参数的设定。
⑤当我们选中“Automatically Change String”后
.Oligo
会在引物搜索过程中:如
果在高
等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索
.
知
道找到引物对。
在设计反向
PCR
引物
对时
.
就选中“Inverse
PCR”复选框。
⑥我们还可以让引物的长度可以改变
.
以适应设定的
Tm
值或
PE
?(
Prime Effit
ions.
引发效率)。也可以限定所选引物对的最大数目。
⑦在“Parameters”窗口中
.
实际上需要我们改动的只有引物的长度
.
根据试验的要求
p>
作相应的改变
.
如
23nt
。其他参数就使用
Oligo
的默认值
.
一般无需改变。在“More
Parameters“窗口中
.
一般也无需作任何改变<
/p>
.
直接用
Oligo
的默认值。
4.
点击“确认”-
“Ok”进入搜索窗口
.
再次单击“OK”后
< br>.Oligo
自动完成引物对的
搜索
.
并出现一个搜索结果窗口。显示出得到的引物对数目。
5.
点击“Ok”
.
< br>出现“PrimerPairs”窗口
.
在窗口中列出了
7
对引物的简单信息
.
引物
位置
.
产物长度
.
最佳退火温度及
GC
含量。
单击“Sort”按钮
.
可以按
产物长度
.
最佳退
火温度及
GC
含量从小到大或从大到小的顺序排列。
p>
6.
点击任意一对引物
.
< br>在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口
.
在窗口中我们
可以看到
这对引物在模板中的大概位置
.
最佳退火温度
(该温度可以直接应用于我们实际
PCR
中
的第二步退火)
。
另外还有引物的
Tm
值
.GC
含量
.
引发效率
.
p>
同时还计算出了产物的
Tm
值于引物
Tm
值的差异以及引物间
Tm
值的差异。一般我们尽量保持前者在
20
度以内
.
后者在
5
-
6
度以内。点击不同的引物对时
.PCR
p>
窗口内容同时作相应的改变。
7.
要想了解引物的详细信息
.
如二聚体
.
发卡结构形成情况、组成、
Tm
值和错误引发位
点等
.
这时
只需点击“Analyze”菜单中的相应命令
.
就可以分别得
到相关信息。
例如点
击“Duplex Formation”
.
我们就可以得到上游引物间
.
下游引物间及上下游引物间形
成二聚体的情况。同理
< br>.
“Hairpin
Formation”
.
“Composition and
Tm”
.
“False
Priming
Sites”等命令就可以显示出相关信息。
所有这些分析的结果都有助于我们从
Oligo
搜索得到的多对
引物中选择最佳的引物对。
需要说明的是
.1.
如果一次搜索得到的引物对太多时
.
我们可以适当提高选定的条件和
规定更合适的搜索范围来减少引物对数;
2.
引物一般尽量不要在
3’端或是离
3’端太
-
-
-
-
-
-
-
-
-
上一篇:MLA和APA写作格式
下一篇:SCI,SCIE,EI等简介