-
遗传毒性试验能检出
DNA
损伤及其损伤的固定
。
根据检测的遗传学终点分为
4
p>
种类型
:
1
检测
基因突变(比如:
Ames
试验)
;
2
检测染色体畸变(比如:微核试验)
;
3
检测染色体组畸变(比如:体外
CHL
细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验)
;
4
检测
DNA
原始损
伤
(比如:
单细胞凝胶电泳分析
(si
nglecellgeleletrophoresis,SCGE)
)
。
以上检测结果为呈阳性
(
除外假阳性)
的化合物,
为潜在人类致癌剂和
< br>/
或致突变的物质。
FDA
于
2006
年
制定了遗传毒性试验结果的综合分析法指导原则
(
Guidan
ceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachesto
integrationofgenetict
oxicologystudyresu
lts
)
对遗传毒性试验的阳性结果评价和处理:
ICHS2
(
R1
)中的遗传毒性
结果评价和追加试验策略。
目前已
建立的遗传毒性短期检测法已超过
200
种。
< br>
1
现行组合试验方案,用一组试验配套进行试验。<
/p>
200
多种检测方法中
,
真正经过验证有合
适灵敏度和特异度的大概不到
10<
/p>
种。
目前多数国家规定
,
如体内诱变试验显示
1
个或以上试
验呈阳性结果
,
则需要进行生殖细胞遗传毒性测试。
2
各类遗传毒性试验方法的研究进展
2.1
检测基因突变
2.1.1
Ames
试验
Ames
试验是检测化学物质基因突变的常用方法。常规的
A
mes
试验选用
四个测试菌株
(TA9
7
、
TA98
、
TA100
、
TA102),
最近有
人提出增加
TA1535
测试菌株
,<
/p>
该菌株特
别适用于检测混合物的致突变性。目前出现的新生菌株具
有更高的敏感性和特异性
,
如
YG70
14
、
TG7108,
缺乏编码
O6-
甲基鸟嘌呤
DNA
甲基化转移酶的
ogtST
基因
,
专用于对烷化剂
引起的
DNA
损伤检测
;
引入乙酰转移酶基因的
YG1024
、
YG1029
菌株
,
对硝基芳烃和芳香胺的
敏感性
比原菌株高
100
倍以上
[4]
。
测试代谢活化系统一般采用由
Aro-cl
or1254(PCBs)
诱导
大鼠肝微粒体酶的
S9;
国外也有用人肝
S9
的报道
,
试验证明其代谢活性明显高于鼠
S9[5,6]
。
为了克服
S9
p>
制备上的困难和不稳定性
,Josephy
等将沙门氏菌的芳香胺
N-
乙酰转移酶基因和
< br>人类细胞色素
P-450
基因
C
yp1A2
引入细胞
,
构建了在无外源
S9
时也可检出芳香胺诱变性的
Ame
s
测试菌株如
DJ4501A2[7]
。
2.1.2
TK
基因突变试验
< br>TK
基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正向突变试验
,
近年
来其应用价值有明显的提高。
TK
基因编码胸苷激酶
,
该酶催化胸苷
的磷酸化反应
,
生成胸苷
单磷酸
(TMP)
。
如果存在三氟苷
(TFT)
等嘧啶类似物
,
则
产生异常的
TMP,
掺入
DNA
中导致细胞
死亡。如受检物能引起
TK
基因突变
,
胸苷激酶则不能合成
,
而在核苷类似物的存在下能够存
活。
TK
基因突变试验可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他
较大范围
基因组改变在内的多种遗传改变。试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞<
/p>
L5178Y
以及
人类淋巴母细胞
TK6
和
WTK1
等
。其基因型均为
tk+/-
。
Honm
a(
本间正充
)
和张立实
(1999)
指
出原用染毒时间
3
~
6h
对于充分检出断裂剂和锤
体来说这个时间太短
,
获阴性结果时应延长
至
24h
。
据资料显示对于同一阳
性受检物
,WTK1
细胞的突变频率远高于
TK6
细胞
,
认为与
WTK1
存在
p53
基因突
变有关。
Do-brovolsky(1999)
建立了
tk+/-
转基因小鼠
,
可用于体内试验。
2.1.3
转基因小鼠基因突变试验
转基因小鼠
基因突变试验可在整体状态下检测基因突变
,
比较不同组织
p>
(
包括生殖腺
)
的
突变率
,
确定靶器官
,
对诱发的遗传改变作精确分析等
[8]
。
1989
年
Gossen
等
报道了
LacZ
转基因小鼠突变测试系统。
近年来
,
国外已陆续发展了多种用
于突变检测的转基因动物
,
其中
3
p>
种已投入商品化生产
,MutaTM
小鼠、
Big-BlueTM
小鼠和
Xeno
mouse
小鼠
,
它们分别采用大肠杆
菌乳糖操纵子的
LacZ
和
/
或
Lacl
作为诱变的靶基因。
陈建泉等人
(1997)
已经以穿梭质粒
pESnx
载体
,
以
xy1E
基因因为诱变靶基因建立了携带
xy
1E
的转基因小鼠
,
并对转基因小鼠进
行了繁殖建系。并已实验证明
xy1E
转基因小鼠是一
个研究体内基因突变的有效模型
,
它可望成为一
种新的转基因小鼠突变检测系统
[9]
。
Heddle
等
(2000)
建立了
1
个种
gptdelta
转基因小鼠。
HiroyukiHayashi
等<
/p>
(2003)
将载有
t
< br>基因和
λ
噬菌体的
red/ga
m
基因
λ
EG10DNA
整合到
SD
大鼠每个单倍体基因组
< br>q24
~
q31
位点。
这种转基因大鼠对乙基亚硝基脲
(ENU)
和苯
并芘
(B[a]P)
的肝脏毒性显示了很好的敏感性
,
它
也有助于研究遗传毒性物质对小鼠和大鼠的种
间差异
[10]
。
2.1.4
反向限制性酶切位点突变分析法
< br>(inverserestrictionsitemutation,iRSM)
由英国
威尔士大学分子遗传和毒理中心建立并完善的
[11]
。
iRSM
适用于快速检测诱变剂所致
体内
外
DNA
的突变
< br>,
但这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点。该方法建立者
Jenkins
等首先将
iRSM
应用于化学诱变剂所致动物体内
p53
基因的突变检
测
,
取得了良好的
结果
:
小鼠分别口服
N-
乙基
p>
N-
亚硝基脲
(ENU)
< br>、
2-
乙酰氨基芴
(2-AAF
)
和二甲基酰肼
(DMH)3
天后
p>
,
以
iRSM
方法
相应地检测小鼠脾、骨髓和肝组织
p53
基因第
6
内含子区域的
Apa
→
p>
Ava
位点反向突变。
结果表明
ENU
诱发肝组织
p53
基因突变的发生率为
33%,2-AAF
使肝组织突变
的发生率为
25%,
这一阳性突变率反映出了不
同诱变剂对相应组织的致突变强度
,
进一步验
< br>证了该方法的高灵敏度和准确性。
它具有灵敏度高、
快速
、
操作简便、
以及突变检测部位明
确等
优点
,
应当说是一种较具实用价值和生命力的突变检测手段。但
是
,iRSM
的不足之处是
仅能检测诱
发限制性酶切位点反向的
DNA
突变。根据文献资料分析
,
化合物致突的发生具有
一定的规律性
,
即结构类似的一组化合物常常引起一些特定序列较固定的碱基改变。
例如
,
烷化剂和芳香胺类虽易使一连串鸟嘌呤
< br>(G)3
′端
G
发生突变
[12,13],
这可能与该部位电荷
密集有
关
,
多数活性氧生成物质的
DNA
p>
致突作用也具有类似规律
[14];CpG
二核苷常常是
DNA
加成物致突变作用部位
[15],
所以
CpG
突变的检测
在化合物致突检测中具有重要意义
,
而
CpG
突变常引发某些固定酶切位点的变化。
很显然
,iRSM
可较广泛地应用于遗传毒性化合物致突
作用的检测。
2.2
检测染色体和染色体组畸变
2.2.1
微核试验
传统的体内微核试验仍然是检测化学物质染色体损伤的基本方法。目前
微核试
验方法主要有以下改进
:1
体外微核试验
常用细胞有中国仓鼠肺细胞
(CHL)
、
中国仓
鼠卵巢细胞
(CHO)<
/p>
及中国仓鼠成纤维细胞
(V79)
等
p>
,
近年开始有用
L5178Y
小鼠淋巴瘤细胞和
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