-
分子生物学基本技术
包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等
第一节
DNA
的体外合成
< br>一、
DNA
的化学合成
（无要求
）－亚磷酸三酯法
DNA
的
化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工
合成基因和反义寡核苷酸。
目前寡核苷酸均是用
DNA
合成仪合成的，大多
数
DNA
合成仪是以
固相亚磷
酸三酯法
为基础设
计制造的
合成的原理：
核酸固
相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定
在一种不溶性高分子固相载
体上，
然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序
逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，
由于接长的核酸
链始终被固定在固相载体上，
所以过量的未反应物或反应副产物可通
过过滤
或洗涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相
载体上切割下来并
脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。
（末端核苷酸的
3
′
-OH
与
固相载体成共价键，
5
′
-OH
被二甲氧基三苯甲基
(
DMT
)
保护
，下
一个核苷
酸的
5
′
-OH
亦被
DMT
保护，
3
′
-OH
上的磷酸基
上
氨基亚磷酸化合物活化
。
碱基上的氨
基用苯甲酸保护。每延伸一个核苷酸需四步化学反应
(1)
脱
DMT
游离出
5
′
-OH
。
(2)
缩合（偶联反应）
：新生成的
5
′
-OH
与
下一个核苷活化的
3
′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长
(3)
盖帽（封端
反
应）
：有少量
(
小于
0.5%)
未缩合的
5
′
-OH
要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催<
/p>
化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
(4)
氧化：新增
核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（
磷酸三酯）
。
上述步骤循环一次，核
苷酸链向
5
′方向延伸一个核苷酸
二、聚合酶链式反应技术
聚合酶链式反应
(polymerase
chain
reaction,PCR)
是一种体外特定核酸序列扩
增技术。
一
)PCR
的基本原理
双链
DNA
热变性成两条单链，降温使反应
体系中的两个引物分别与两
条
DNA
单
链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热
DNA
聚合酶
以单链
DNA
为模板，利用反应体系中
的
4
种
dNTP
合成其互补链
(
延伸
)
，
在适宜的条件下，
这种变性→复性→延伸的循环
重复
1
次
DNA
的量可以
增
加
1
倍，
30
次循环后，
DNA
的量增加
2
30<
/p>
倍。
(
二
)
典型
PCR<
/p>
的反应体系
1.
耐热
DNA
聚合酶：
耐热
DNA
聚合酶包括
Taq DNA
聚合酶，
Tth
DNA
聚合酶，
VENT
DNA
聚合酶
，
Sac DNA
聚合酶。其中
Taq
聚合酶应用最广泛。
Taq
酶在
92.5
℃、
95<
/p>
℃和
97.5
℃时半衰期分别为
40min
、
30min
和
5-6min
，故
PCR
中变性温
度不宜高于
95
℃。
Taq
酶的最适温度是
72 <
/p>
℃，较高温度下的
DNA
合成错
误率较低。
因此一次加酶可满足
PCR
反应全过程的需要，
使
PCR
走向自动
化。
纯化的
Taq DNA
聚合酶有
5
′→
3
′外切酶活
性，
而无
3
′→
5
′外切酶
活性，
无校对活性。
因此在
PCR
中每
2
╳
104
个核苷酸中有可能掺入
1
个错
误核苷酸，这对一般的
PCR
产物分析不会有多少影响，但将
PCR
扩增产物
用于分子克隆时，需使用更准确的
D
NA
聚合酶。
在
100
μ
L
反应体
系中，一般需
Taq DNA
聚合酶
0
.5-5
单位，酶浓度过
高，可引起非特异产物的扩增，浓度过
低则扩增产物量减少。
Taq
DNA
酶
可在
-20
℃贮存至少
6
个月
2.
PCR
反应的缓冲液：
PCR
的缓冲液一般制成
10
×，含有：
500m
mol/L
KCl;100m
mol/L
Tris-
HCl(pH8.3)
；
15m mol/L
MgCl2;0.1%
明胶。
使用时
要稀释
10
倍。
其中
< br>Tris-HCl
可维持反应体系的
pH
，
KCl
有利于
引物的退火，
但浓度过高会抑制
Taq
DNA
聚合
酶的活性，明胶可保护酶不
变性失活，
Mg2+
能影响
Taq
酶的活性，影响反应的特异性和扩增
DNA
的
产率，因此要将
< br>Mg2+
。
3.
引物：
PCR
反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引
物设计一般遵循以下原则：
(1)
引物长度
一般为
15-30b
，引物太短，就可能同非靶序列杂交得到
不需要的扩增产物
。
(2)G+C
含量
< br>G+C
含量一般为
40%-60%
。
引物的
G+C
含量和引物
Tm
值应该协调，按公式
Tm=4(G+C)+2(A+T)
估计引物的
Tm
值。
(3)
碱基的随机分布
引物中
4
种碱基应随机分布，不要多个嘌呤或多个<
/p>
嘧啶连续出现。
引物自身不应存在互补序列，
以免自身折叠成发夹结构影响
与模板的退火结合。两引物之间也不应有互补性，尤其
是避免
3
′端的互补
而形成引物二聚体
，使靶序列的扩增量下降。
(4)
引物浓度
引物的浓度一般为
0.1-0.5
μ
mol/L
，引物浓度偏高会引起
错配和非特异性产物扩增。
：
dNT
P
常用的浓度为
20-200
μ
mol/L
，而且
4
种
dNTP
的终浓度相等。
dNTP<
/p>
浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误参入率，适当的低
浓度会提高反应的精确度。另外，
dNTP
是磷酸根的来源，
会与
Mg2+
结合，
也应注意协调
Mg2+
浓度和
dNTP
< br>浓度之间的关系。
5.
模板
DNA
模板可
以是基因组
DNA
、质粒
DNA
、噬菌体
DNA
、扩增后的
< br>DNA
、
cDNA
等，
RNA
的扩增需要首先逆转录成
cDNA
后才能进行正常
PCR
循环。
含有靶序列的
DNA
可以单链或双链形式加入
PCR
混合液。
通常小片段模板
DNA
的
PCR
效率要高于大
分子
DNA
，因此
PCR
反应前用机械剪切或用稀
有限制酶酶解基因组
DNA
，以提高产量。
PCR
反应中模板加入量一般为
102-105
拷贝的靶序列。
6.
温度循环参数
变性温度一般为在
90-95
℃。变性所需
的时间取决于
DNA
的复杂性，
一般用
94
℃
30
s
对模板
DNA
进行变性，过高的温度
及过长的时间会降低
Taq
酶的活性。引物的退火温度通过
Tm=4(G+C)+2(A+T)
计算得到，一般
55-80
℃
30s
。延伸温度选在
70-75
℃之间，此时
Taq
酶活性最高。延伸反应
的时间根据扩
增片段的长度而定，
一般
1
kb
以内延伸
1 min
，更长的片段
需
相应延长时间。
PCR
的循环次数取
决于模板
DNA
的浓度，一般
25-3
0
次。
循环次数越多，非特异性产物也越多
(
三
)PCR
< br>技术的扩展
典型的
P
CR
经过一定的调整可用于特殊的研究工作，
使
PCR
技术扩展
到分子生物学的各个方面
，较常用的技术扩展有：
1.
“
巢式
”
PCR(nested PCR)
先用一
对引物对模板进行扩增，
然后再用另一对引物扩增第一对引物扩
增的产物，这一
PCR
技术即巢式
P
CR
。第一次扩增所用引物称外引物
(outer-prime
r)
，第二次扩增作用的引物称内引物
(inter-
primer)
。
进行<
/p>
“
巢式
”
PCR
可将外引物设计得比内引物长一些，
且用量较少，
用外
引物进行时，
采用较高退火温度使内引物不能与
模板结合，
故只有外引物扩
增。
经过若
干循环，
待外引物基本消耗完毕后，
只需降低退火温度即可直接
进
行
内
引
物
的
PCR
扩
增
。
这
种
PCR
技
术
被
称
为
“
中
途
进
退
式
< br>”
PCR(drop-in-drop-out
PCR)
。
“
巢式
”
及
“
中途进退式
”
PCR
主要用于极少量模板的扩增。
2.
复合
PCR(multiplex
PCR)
在同一反应中用多组引物同时扩增
几种基因片段的方法称复合
PCR
。
复
合
PCR
主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体。此外
也常用于
多点突变性分子病的诊断。
3.
不对称
PCR(asymmetric
PCR)
两种引物比例相差较大的
PCR
称不对称
PCR
。
不对称
PCR
可制备用于
核酸序列分析的单链
DNA
片段或核酸杂交的探针
等。
4.
反转录
PCR(reverse
transcription PCR)
由于<
/p>
Taq
酶只能以
DNA
< br>为模板，当待扩增模板为
RNA
时，需先将其
反转录为
cDNA
才能进行
PCR
扩增，
这种
PCR
技术称为反转录
PCR
，
在分
子生物学和临床检验等领域均有广泛应用。
5.
涂片
PCR(slide-
PCR)
直接对载玻片上细胞涂片或组织切
片进行
PCR
扩增的方法称涂片
PCR
。涂片
PCR
结合原位杂交技术特别适
用于病理切片中含量较少的靶序
列的
PCR
检测。
6.
反向
PCR(inverse
PCR)
扩增引物相反方向
DNA
序列的
PCR
技术称反
向
PCR
。
在反向
PCR
中，
要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知
DNA
片段进行酶切和环化，然后
直接进行<
/p>
PCR
，也可将已知序列酶切后再进行
P
CR
。反向
PCR
主要用于已
知序列两翼未知
DNA
序列的扩增。
7.
锚定
PCR(anchored
PCR)
用酶法在一通用引物反转录的
cDNA 3
′端加上一段已知序列，然后以
此序列为引物结合位点对该
cDNA
进行
PCR
扩增称为锚定
PCR
，可用于未
知
cDNA
的制备及低丰度
cDNA
文
库的构建。
8.
修饰引物
PCR
为达到某些特殊应用目的如定向克
隆、
定点突变、
体外转录及序列分析
等
，可在引物的
5
′
-
< br>末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分
析物结合位点等，这种
PCR
技术称为修饰引物
PCR
。此外，还可将一些信
号分子如荧光素、生物素等连接于引物的
5
′末端，当
PCR
完成后
可对产
物直接进行检则。
PCR
在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。
第二节
核酸的分子杂交
核酸分
子杂交技术是分子生物中最常用的基本技术之一。
其基本原理是
具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成
双链。此杂交过
程是高度特异性的。
杂交的双方是待测核酸序列及探针
。
待测核酸序列可以是克隆的基因片
段，
也可以是未克隆化的基因组
DNA
和细胞总
< br>RNA
。
将核酸从细胞中分离
纯
化后可在体外与探针杂交
(
膜上印迹杂交
)
，也可直接在细胞或组织内进行
原位杂交。
用于检测的已知核酸片段称之为探针
(probe)
。
为了便于示踪，
探针
必须
用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性核素，
近年来也发展了一些非放射性标记物。
检测这些标记物的方法都是极其灵
敏
的。
核酸分子杂交技术被广泛应用于基
因克隆的筛选和酶切图谱制作、
基因
组中特定基因序列的定量和
定性检测、基因突变分析以及疾病的诊断等方
面。
它的应用也大
大推进了分子生物学的迅猛发展，
如基因芯片就是分子杂
交技术
进一步扩展的产物。
核酸的原位杂交有广阔的应用前景
，
但现时操作较繁，
较易出现假阳性，
故本节只介绍膜上印迹杂交。
一、探针的种类与选择
核酸分
子探针可以分为基因组
DNA
探针、
c
DNA
探针、
RNA
探针及人
工合成的寡核苷酸探针等种类。
探针选择正确与否，
将会直接影响到杂交结