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CRISPR
技术操作指南
十年前,当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为
CRISPR
结构的时候,他们并没有预料到这会给基因编辑
世界带来一场风暴。
在过去的这一年半时间里,
CRISPR
方法已迅速席卷了整个动物王
国,成为
DNA
突变和编辑的一种
“
马上
”
技术
——
迄今为止在几乎每
种实验细胞类型中都能起作用,包括人类细胞,小鼠
,斑马鱼和果蝇
细胞;这种技术也易于操作,已经有两个研究组利用
CRISPR
分析
了人类细胞
中几乎每个基因单突变(详细报道
Science
:
CRISPR/Cas9
加速基因挖掘
;
Science
:张峰建立
< br>CRISPR/Cas9
人细胞敲除体系
)。就在最近,
CRISPR
还帮助研究人员完成了携
带特殊基因中断(
gene disruptions
)的工
程猴,这项壮举此前曾在
小鼠中实现过,但未在灵长类动物中完成过(详细报道
Cell
:中国
科学
家利用
CRISPR/Cas9
技术构建基因工程猴
)。
CRISPR
本身是一种防御系统,用以保护细菌和古细菌细胞不
受病毒的侵
害。在这些生物基因组中的
CRISPR
< br>位点能表达与入侵
病毒基因组序列相匹配的小分子
p>
RNA
。当微生物感染了这些病毒中
的一种
,
CRISPR RNA
就能通过互补序列结合病毒基因组,并表达
CRISPR
相关酶,也就是
p>
Cas
,这些酶都是核酸酶,能切割病毒
DNA
,阻止病毒完成其功能。
将
CRISPR/Cas
系统用于其它非细菌细胞需要满足两个
条件:
一个
Cas
酶,
用于切断靶标
< br>DNA
,
比如目的基因中的
DNA
片段,
另外一个就是称为导向
RNA
(
gRNA
< br>)的
RNA
分子,这种分子
能
通过互补结合靶标。
gRNA
也就是细菌细胞中
CRISPR
RNA
的一
个更短的版本,它能与
Cas
形成复合物,指导
Cas
到达正确的剪
切位点。不过研
究人员也可以通过结合其它元件,或者改变
Cas
活
性,来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。
“
目前,非传统基因编
辑应用方面的生物学家利用一种新工具,
分析细胞中,和整个生物机体中突变的作用
p>
”
,来自加州大学伯克利
分校的生物化学教
授
Jennifer Doudna
表示,
< br>她与她的同事解析了细
菌细胞中
CRISPR
的作用机制。近期,
Doudna
研
究组利用这种工
具,首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。
不过
CRISPR
技术也存在一个主要的缺点,那就是缺乏特异<
/p>
性:一些
gRNA
分子结合的
DNA
只是部分与
gRNA
互补。在这
一方面,其它基因编辑方法,如锌指核酸酶(
ZFN
)和
TALENS
可
能要比
Cas - gRNA
更为具有优势,因为这两者需要识别更
长的靶
标
DNA
序列。
但是
ZFN
和
TALENS
方法在克隆和细胞表达方面
要比
gRNAs
难得多,而且研究人员通常还需要验证十几个不同的
TALENS
,以及几十个不同的
ZFNs
,来证明其中一个有效。
近期
《科学家》
(
The Scientist
)
杂志
汇总
了基因编辑过程中
Cas
和
gRNA
的处理过程及解决方案,用于帮助新接触这一技术的
研究
人员熟悉这项热门技术。
如何
CRISPR
我的靶标?
由于
CRISPR
系统并不复杂,因此我们所要做的就是将带有质
粒(能表达
Cas
和
< br>gRNA
)的细胞进行转染。研究人员可以采用一
种
p>
Cas
的变体,即
Cas9
,这种酶来自于一种链球菌,由
RNA
进
行指引,
能无需其他蛋白的帮助而切割
DNA
(
Science, 337:816-21,
2012
)。
Cas9
既能切断与
gRNA
结合的
DNA
链,也能切断其互
补链。目前可以
从
Addgene
购买
Cas9
质粒
(
65
美元),将其直
接转染入细胞。
gRNA
的长度约为
80
个核苷酸,
包含两个区域:
gRNA 5'
端
前
20
个核苷酸对应于靶标
DNA
,能结合在靶标
DNA
上,剩余的
约
60
个核苷酸
(
gRNA
长度取决于表达
gRNA
的质粒)
形成一个
发夹结构,这个结构能帮助<
/p>
gRNA
与
Cas9
结合,并由此指导与
DNA
的结合。
gRNA
与
Cas9
一样,也是通过质粒表达的,从
Addgene
可
以购买几种这种质粒(
65
美元),但是与
Cas9
不同的是,我们需
要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。
我们可以设计一个编码
20
个
碱基,与靶标
DNA
结合的片段,将其克隆进表达质粒里(编码
gRNA
其它部分的
60
个核苷酸已经在质粒中了)。唯一的设计要求
就是,
gRNA
上要有一个片段,能与由任意核苷酸序列(
N
p>
)
+5'
末
端两
个胞嘧啶核苷酸(
-NCC
)的
DNA
结合。这是因为
gRNAs
似
乎与相对链包含两个鸟
嘌呤残基(
-NGG
)的
DNA
片段结合最好,
这种
-NGG
序列也就是
PAM
结构(
protospacer adjacent
motif
)。
要在靶标
DNA
区域中挑选合适的
20
个碱基对,有几个方案可以
选择,比如麻省理工学院的
CRISPR Design
(
);德
国癌症研究中心开发的
E-Cr
isp
(
/E-CRISP/designcrispr
p>
);还有
ZiFiT targeter
(
/ZiFiT/ChoiceMenu
)。另外也可以筛选整个基因
组,找到与你的靶标位点相似的其它位点。
其中只有
CRISPR Design
和
E-Crisp
可以预测哪些
gRNA
序列特异性最强,
ZiFiT
不具有
这种功能。但是由于这些预测位点周
边的不确定性,研究人员仍然无法确保
gRNA
的严格特异性,因此
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