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中国牛业科学2012,38(4):1-5
Chi
n a Catt
le Sci
ence
科学试验
信阳水牛GHR
H基因第二外显子的SNPs检测
徐永杰
,吴海港 ,姚 瑾 。,刘 英 ,梁小娟 ,马 云¨
(1.信阳师范学院生命科
学学院,
河南信阳464000;
2.信阳农业高等专科学校,河南信阳4640 00;
3.江苏大学生命科学学院,江苏镇江212013;
)
摘 要:[目的]检测信阳水牛群体GHRH基因的SNP多
态性。[方法]以56头信阳水牛为
材料,采集血样,提取基因组DNA,以GenB
ank公布的牛GHRH基因(gi:194719389)序列
作为参照序列,设计
PCR引物,采用PCR—SSCP和DNA测序方法对该基因第二外显子的
进行突变
检测。[结果]经SSCP分析发现,这些个体总共出现六种不同的带型。测序结果
表
明:位于GHRH基因的4 461
bp、4 529 bp、4 845
b p、5
053 bp和5 058 bp处分别存在C
—T、T—G
、G—A、G—A和G—T五个单核苷酸突变。[结论]表明该基因在信阳水牛群体
中
单核苷酸多态较为丰富。
关键词:信阳水牛;GHRH基因;SNPs
;PCR—SSCP
中图分类号:¥823.2
文献标识码:A < /p>
文章编号:1001—9111(2O12)04—0001-05
然而
,近年来信阳水牛的存栏数呈现快速、持续
引言
下降趋势,
加之信阳水牛饲养业得不到应有的重视,
信阳水牛主产于河南省信阳市
,中心产区为信
科技普及力度不够,饲养周期长、经济效益低,群众
阳市的光山、罗山、固始、商城、新县等县区[
1
]。信阳
< p>的养牛积极性不高;而且信阳水牛品种分布不合理,
水牛属牛科、
水牛属,于1983年被列入《河南省地
对于一些引进的品种在分布上也不能形成规模,原 < /p>
方优良畜禽品种志》,2003年被列人《中国畜禽遗传
始的放
牧式养牛方法还普遍存在;品种结构不合理,
资源名录》,体型较大、
体质结实、结构匀称,胸宽深,
缺乏龙头企业带动,没有形成产业化经营,这些 禁锢
肋骨开张良好,背平直而宽,尻宽广而倾斜,而且性
着
水牛业发展的诸多问题亟待解决 ]。因此,在分
情温驯、喜水、繁殖性能、适应性强
,耐粗饲l
_
2
],这些
子水平上运用
现代技术对信阳水牛进行遗传育种改
优点使得信阳水牛在役用方面备受推宠。随着农业
良以促进水牛业的发展,具有极其重要的意义。生
机械化水
平的不断提高和农业现代化的逐步实现,
长激素释放激素(growt
h hormone
rel
easi
ng ho r—
信阳水牛的经济用途已逐步从单纯的役用向乳、肉
mone,
GHRH)是下丘脑合成和分泌的小分子蛋白,
方向转化。信阳水牛肉质较好,在营养价值很高的
是一种直接或间接的
免疫功能状态下维持生理和病
牛肉中占有很大的比例;其水牛奶浓稠、清香,没有 <
/p>
理的下丘脑激素 ],是促进生长激素分泌的重要的
膻味,营养
价值很高,总固形物达2O ,是普通牛奶
一
种正性调控因子
。牛的下丘脑分泌的GHRH有
1.7倍,蛋白质达4.5 ,比普通牛奶高出1.3
个百
3种形式,分别由44、4O、37个氨基酸组成。研究证
分点,而且水牛奶中钙、铁、磷、维生素A、维生素E
明这3种GHRH均具有生
物活性,其中以44肽的
等含量非常丰富
,是老幼皆宜营养食品,水牛 奶将
活性最高,Barendsec
利用基因连锁分析法把牛的 < /p>
成为消费新宠【
3
]。由此可见,信阳水牛有着举足轻 < /p>
GHRH基因定位于13号染色体上,并证明牛的
重的价值性和
极好的发展潜力。
GHRH基因由5个外显子和4个内含子组成_
p>
7
,对
收稿日期:
2012—
< p>04—04
修回日期:
2012—
04—16
基金项目:
河南省科技攻关项目(092300410 010);
河南省高等学校骨干教师资助计划
作者简介:
徐永杰(1980一),
男,
河南商城县人,
讲师,
< p>主要从事动物分子遗传研究。
*通讯作者:马
云( 1974一
),男,宁夏平罗县人,副教授,
主要从事动物分子遗传育种研究。< /p>
2
中国牛业科学
第3 8卷
普通牛GHRH全基因测序得到的基因全长为9 356
1.1.2 主要试剂 Gol
den DNA聚合酶(Pol
ymer— p>
ase)、2×Reacti
on Mi
x 、dNTP、Marker
DL2000、琼
bp_
8
]。GHRH基因具有多种极其重要的作用,其主
要功能是诱导并刺
激垂体促生长区的细胞合成和释
放生长激素。通过注射GHRH刺激牛、羊、猪、猴
和犬的研究表明,GHRH
的促
GH释放活性较
高 。 。此外,GHRH在其他方面也有不可或缺的
作用,例如:
GHRH有助于
HI
V患者骨骼的增
强l
l
;GHRH还具有免疫调节的功能I
1
。
脂糖、Tri
s饱和酚、蛋白酶K等购自郑州久是生物
技术有限责任公司;
其他试剂均为国产分析纯;引物
合成和
测序由南京金斯瑞生物科技有限公司。
1.1.3 主要实验仪器
p>
PCR仪(型号:Gene
Amp
PCR System
9600);电泳仪(型号:DYY一6C型);水
平电泳槽(型号:DYCP一31
B);垂直板电泳槽(型号:
近年来有关黄牛、牦牛等的GHRH基因
的多
态性及与生产性能的关联分析等已有相关的研究报
道l
l
。 ,但在信阳水牛上,至今尚未见有关GHRH
基因影响其生产性能的报道,本研究运用PCR—SS—
DYCZ一2
OA);凝胶成像系统(型号:UVP GDS一
8000)。
1.2
实验方法
1.2.1 D
NA提取与检测
采用传统的氯仿提取
法
提取信阳牛 血样基因组
DNA,提取后的
CP结合测序的方法,对信阳水牛的GH
RH基因的
第二外显子进行突变检测,以期为进一步进行生产
性状的关联分析,发现与重要经济性状相关的DNA
DNA用TE缓冲液溶解后,采用0.5
琼脂糖凝胶
分子遗传标记,对信阳水牛的遗传育种改良以促进
p>
水牛业的发展具有极其重要的意义。
电泳检测和紫
外分光光度计测定浓度后,一80℃保存
备用。
1.2.2 PCR引物的设计与合成 参照NCBI(Na—
t
i
onal
Center
f
or
Bi
otechnol
ogy Inf
ormat
< p>ion)数据
库中公布的GHRH基因序列(gi:194719
389)以及
外显子序列,利用Pri
mer 5.0软件自行设计G HRH
基因的第二外显子序列的PCR扩增引物,由上海生
物工程技术服务有限公司进行引物合成,序列信息
见表1。
1
材料与方法
1.1
实验材料 p>
1.1.1
样本
采集共计56头均无血缘关系的信阳
水牛(旱)的静脉血液,加入抗凝剂ACD摇匀(血液:
ACD=6:1),用加冰块的泡沫箱带回试验室,一20
℃低温冷冻保存备用。
表
1
引物序列信息
< br>在PCR反应为15“L体系,具体如下:2×Re—
acti
on Mi
x 7.5ⅡL、Gol
den Taq DNA聚合 酶(5 U/
f
L)0.1
uL、引 物GHRH2S(上游引物,10 p.
mol
/
L)
0.1
L、引物GHRH2A(下游引物,10 f
f
mol/ L)
迅速倒人玻璃板内,插入梳子;室温下凝胶约
30
mi
n后,小心拔出梳子,立即用蒸馏水立刻冲洗点样
孔,取出橡胶条,将注有胶的玻璃板放到垂直电泳槽
内,加入电泳缓冲液;
取4 L PCR产物,加6 L变
性缓冲液,瞬时离心后PCR仪中98℃变性10
mi
n;
取出变性后的PCR产物立即埋入冰中,冰
浴5
mi
n
后迅速上样,并作好点样顺序记录,冰浴
条件下250
V电压电泳20 mi
n,而后16O V电压电泳20 h;取
0.1
L、无菌水6.2 L、DNA模板(1 g/ L )1.0
L。按照如下条件进行扩增:95℃预变性10 mi
n;< /p>
94℃变性30 S,63.4℃退火4O S,72。
C延伸30 s,
循环32次。
1.2.3 PCR结果的琼脂糖电泳检测
取
2.0“L
凝胶:电泳结束后切断电源,卸下胶板,将凝胶从玻
PCR产物,点样于1.
5
琼脂糖(0.21 g琼脂糖,16
mL 1×T
BE缓冲液)凝胶胶孑L中,120 V电压,电泳
约35 mi
n, EB(溴化乙啶)染色,紫外灯下观察电泳
结果,并用凝胶成像系统拍照保存。
1.2.4 PCR产物的SSCP检测 洗净烘干玻璃
< br>板,
两板侧边用夹子夹紧,底部用
1%的琼脂糖封
住,放置5 mi
n;将现配的、混匀的8 的PAGE凝胶
璃板中
小心取出,用蒸馏水漂洗2次(每次2O s);银
染凝胶:将染色液(0.1
p>
AgNO。)倒入塑料盘中浸
没凝胶,放在摇床上避光轻轻摇30 mi<
/p>
n,凝胶用蒸
馏水漂洗2次;凝胶显色:加入显色液至浸没凝胶,
边摇边观察,直到凝胶上显现出清晰的电泳带;终止
显色:倒出显色液,用蒸馏水漂洗两次;
凝胶照相:将
凝胶用凝胶成
像系统进行拍照,并作好记录。