东北农业大学主页孙升, 薛良义 , 童丽娟 (宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验

gdf-8

对鱼类骨骼肌生长的作用机制及该

基因的其他功能和特点

,

有必要对

gdf-8

II

进行深

入的研究

.

本文在已获得大黄鱼

gdf-8

I

基础上

,

采用同

源克隆策略

,

首次克隆了大黄鱼

gdf-8

II

开放阅读

框序列

(Open Reading Frame, ORF),

并对其结构、

序列进行了分析

.

收稿日期

:

2008-03-17.

宁波大学学报（理工版）网址：

基金项目

:

国家

863

计划项目（

2006AA10A405

）

;

浙江省自然科学基金（

Y306295

）

;

宁波市自然科学基金（

2006A610083

）

;

浙江省教育厅新苗人才计划项目（

2007R40G2070027

）

;

宁波大学科研基金（

XK0613041

）

.

第一作者

:

孙

升（

1983

－）

,

男

,

浙江台州人

,

在读硕士研究生

,

主要研究方向

:

海洋生物分子生物学

. E-mail: ksun1983@

*

通讯作者

:

薛良义（

1962

－）

,

男

,

浙江宁波人

,

博士

/

教授

,

主要研究方向

:

水产生物基因资源与遗传育种

. E-mail: xueliangyi@

40

宁波大学学报（理工版）

2009

1

材料与方法

1.1

材料

大黄鱼样品于

2006

10

月取自浙江象山

.

用

无菌剪刀取其背肌

,

装于

1.5

mL

离心管

,

迅速置于

液氮中带回实验室

,

于－

70

℃超低温冰箱中保存

备用

.

1.2

方法

1.2.1

基因组

DNA

的制备

采用常规的苯酚-氯仿抽提法进行大黄鱼基因

组

DNA

的制备

[21]

.

1.2.2 PCR

引物设计

参照

GenBank

中已登录的金鲷

(AY046314)

、

石首鱼

(

Umbrina cirrosa

) (AY059386)

等

gdf-8

II

的

cDNA

序列在同源保守区内设计

3

对引物

,

覆盖大

黄鱼

(

Pseudosciaena crocea

)

gdf-8

II

的开放阅读框

序列

.

第

1

对引物

: Myo2-F1: GCTCCAAACATCA

GCCGGGACAT, Myo2-R1: AGTG GCCATGGTGA

TAATGGTCT;

第

2

对引物

: Myo2-F2: GAGGACG

AGGACC ACGCTACG

, Myo2-R2: TCARGAGCAK

CCRCARYGGTC;

第

3

对引物

Myo2-F3: A

TGCTC

GTCTT MCYCGKCCTG

, Myo2-R3: CTCCACCCG

CGGGTCGTACTG

.

以上引物由上海英骏

(Invitro-

gen)

生物技术有限公司合成

,

R

=

A

/

G

;

K

=

T

/

G

< br>;

Y

=

C

/

T< /p>

;

M

=

C

/

A

.

1.2.3 PCR

扩增

以提取的大黄鱼背肌

DNA

为模板

,

经

3

轮

PCR

扩增

. PCR

反应总体积为

25

μ

L,

其中

Taq

酶

< br>(5

U

?μ

L

-1

, Takara)0.2

μ

L, 10

×

PCR Buffer 2.5

μ

L,

MgCl

2 < /p>

(25

mmol

?

L

-1

) 1.5

μ

L, dNTP(2.5