同济大学工业设计抗氧化能力指数(ORAC)测定原理及应用

中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ

◇实验方法学◇

Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ

Ｂｕｌｌｅｔｉｎ

２００６

?１０１５?

抗氧化能力指数（ＯＲＡＣ）测定原理及应用

续洁琨１，姚新生１’２，栗原博２

（１．沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳

１１００１６；２．暨南大学药学院 ，广东广州５１０６３２）

中国图书分类号：Ｒ－０５；Ｒ

３４ ０．５；Ｒ

４４６．１；Ｒ

９７９．９

文献标识 码：Ａ文章编号：１００１—１９７８（２００６）０８—１０１５—０７

摘要：目的介 绍抗氧化能力指数测定方法的原理、应用及

发展前景。方法被译为抗氧化能力指数的ｏｘ ｙｇｅｎ

ｒａｄｉｃａｌ

ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ

ｃａｐａｃｉｔｙ（ＯＲＡＣ）方法，是目前抗氧化研究领域中

为人们所关注的 一个评价方法。该方法以偶氮类化合物

ＡＡＰＨ作为过氧自由基来源，Ｓｏｄｉｕｍ

Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ为荧光指示

剂，维生素Ｅ水溶性类似物Ｔｒｏｌｏｘ 为定量标准，使用荧光微

孑Ｌ板分析仪进行分析。结果方法的专属性、线性、精密度、< /p>

准确度及重复性等与其他抗氧化能力分析方法相比具有诸

多显著的 优点。结论该方法目前已成功应用于生物样品、

植物或食品提取物和纯化合物等多种样品 的体内外抗氧化

能力分析，并有希望在研究氧化与疾病发生关系等方面发挥

重要的作用。

关键词：抗氧化能力指数；自由基；ＡＡＰＨ；ｓｏｄｉｕｍ< /p>

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；

近年来的研究证明老化和各种生活习惯 病的发生过程

ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ

ｃａｐａｃｉｔｙ，ＴＡ Ｃ）进行评价。

上个世纪８０年代末，Ｇｌａｚｅｒ等旧１基于从Ｐｏｒｐｈｙ７ｒｉｄ ｉｕｍ

性的研究，Ｔｅｌ：０２０－８５２２７７９１，Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉｅｋｕｎ＿ ６２５＠ｙａｈｏｏ．

ｃｏｎ．ｃｎ；

姚新生（１９３４一）， 男，博士，中国工程院院士，教授，博

士生导师，研究方向：创新药物和中药现代化，通 讯作

者，Ｔｅｌ：０２０－８５２２５８４９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｏｘｉｎｓｈｅｎｇ ＠ｖｉｐ．ｔｏｍ．

ｃｏｍ；

栗原博（１９５４一），男，博士 ，教授，博士生导师，研究方

向：应激及神经一免疫药理学，通讯作者，Ｔｅｌ：０２０ —

３３０３３３０６．Ｅ，ｍａｉｌ：Ｈｉｒｏｓｈｉ

Ｋｕｒｉ ｈａｒａ＠１６３．ｃｏｎ

万

方数据

< br>由基攻击下荧光特性消失的现象，确立了一种亲水性物质抗

氧化能力的测定方法。 该方法中的自由基来源主要为偶氮

类化合物，２，２＇－ａｚｏｂｉｓ一２一ａｍｉｄｉ ｎｏｐｒｏｐａｎｅ—ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ

（ＡＡＰＨ）热分解产生的过氧 自由基，也可以是Ｆｅｎｔｏｎ反应产

生的羟基自由基。在此基础上，Ｃａｏ等∞’４。 采用抗氧化剂作

用下的荧光衰退曲线下面积（ａｒｅａ

ｕｎｄｅ ｒ

ｔｈｅ

ｃｕｒｖｅ，ＡＵＣ）与

荧光自然衰退 曲线下面积的差，作为衡量抗氧化剂的抗氧化

能力指标，将结果以抗氧化物质Ｔｒｏｌｏ ｘ（６－ｈｙｄｒｏ一２，５，７，８－ｔｅｔ—

ｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ－２ 一ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ

ａｃｉｄ）作为标准进行表达，并将

该 方法命名为ｏｘｙｇｅｎ

ｒａｄｉｃａｌ

ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ

ｃａｐａｃｉｔｙ（ＯＲＡＣ），后

被译为氧自由基清除能力或抗氧化能 力指数测定。

ＯＲＡＣ方法最初以Ｂ—ＰＥ作为荧光底物。虽然Ｂ—ＰＥ具

征，但与合成的荧光素Ｓｏｄｉｕｍ

Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（３’，６＇－ｄｉｈｙ ｄｒｏｘ—

比，Ｂ．ＰＥ是一组大分子蛋白，各种ＰＥ具有不同的荧光强度

和与自由基的反应性。加之分离得到的ＰＥ的纯度限制，很

明，Ｂ—ＰＥ的荧 光具有不稳定性，暴露在激发波长下会很快自

Ｊ。此外，Ｂ—ＰＥ作为从Ｐ．

本实验室在测定ＯＲＡＣ活性时采用的荧光物质Ｓｏｄ ｉｕｍ

７，６’一ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｓｐｉｒｏ『ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ．１［ ３Ｈ］，９’

［９Ｈ］．ｘａｎｔｈｅｎ］．３－ｏｎｅ，ＦＬ）、自由基产生剂ＡＡＰ Ｈ（２，２＇－ａｚｏ—

ａｃｉｄ）购自

日本和光纯药株式会社 （Ｗａｋｏ

Ｐｕｒｅ

Ｃｈｅｍｉｃａｌ

Ｉｎｄｕ ｓｔｒｉｅｓ，

１。ＯＲＡＣ分析使用瑞士Ｔｅｃａｎ公司

ｎｍ ，发射波长

ｎｍ）及Ｍａｇｅｌｌａｎ

４工作站。

基于ＯＲＡＣ反应在７５

ｍｍｏｌ?Ｌ“磷酸钾缓冲液（ｐＨ＝

有荧光强度大，对氧自由基灵敏度高，而且水溶性好¨１等特

ｙｓｐｉｒｏ［ ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ一１［３Ｈ］，９’［９Ｈ］一ｘａｎｔｈｅｎ］一３－ｏｎｅ，ＦＬ）相

ｔｒｏｌｏｘ

难保证不同结果之间的可比性’４’６１。０ｕ等人一。的 研究证

都与活性氧有关¨Ｊ。因此，与健康关系密切的食品，特别是

功能性食品及保健品等抗氧化能力的测定，以及生物体内抗

氧化水平的分析引起了人 们广泛的关注。但由于食品等含

发衰退，使其难以进行定量计算。后来人们在实验中还发

现，Ｂ—ＰＥ会以疏水或氢键作用。８’１１。与天然界中的一大类抗

< br>氧化物质——多酚类非特异性结合，而且对不同物质不同量

表现不同的亲和力。而 ＦＬ与待测样品之间不发生相互作

用，不会干扰样品的测定结果。７

ｃｒｕｅｎｔｕｍ中分离得到的蛋白，成本相对较高。显然，无论从

方法优越性及经 济角度讲，Ｂ—ＰＥ均不如ＦＬ作为荧光指示剂

更为理想。因此，后来Ｂ—ＰＥ被ＦＬ所 代替，使得ＯＲＡＣ方法

有多种数量不同的抗氧化物质，生命组织中也存在多种内源

性抗氧化物质来抵御生命过程中过剩产生的活性氧，因此，

对特定抗 氧化剂的体内外抗氧化能力逐一进行测量难度较

大。加之各种抗氧化剂之间存在相互作用 ，使得测定综合抗

氧化能力比测定特定抗氧化剂的水平更有意义。基于上述

理由，近年来建立起多种分析方法对各种样品的相对总抗氧

化能力（ｔｏｔａ ｌ

得到了快速的发展和广泛的应用。本文在综述ＯＲＡＣ使用

方 法、原理、应用等方面的基础上，也结合本实验室目前的研

ｃｒｕｅｎｔｕｍ中分离的Ｂ 一藻红蛋白（ｐ—ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ｐ—ＰＥ）在自

收稿日期：２００６— ０４—０５，修回Ｅｔ期：２００６—０６—２１

究工作予以说明。

１

作者简介：续洁琨（１９７９一），女，博士生，研究方向：天然产物药理活

Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（３

ｂｉｓ一２一ａｍｉｄｉｎｏｐｒｏｐ ａｎｅ—ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、抗氧化标准物质Ｔｒｏｌｏｘ

（６一ｈｙ ｄｒｏ－２，５，７，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｈｒｏｍａｎ－２一ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ

Ｌｔｄ．），其结构式见Ｆｉｇ

Ｇｅｎｉｏｓ型号多功能荧光分析仪（激发波长 ４８５

５３８

７．４）环境中进行，ＦＬ以该缓冲液配制成高浓 度储备液，小体

?１０１６?

中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ< /p>

Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ

Ｂｕｌｌｅｔｉｎ

２００６

Ａｕｇ；２２（８）

积分装后４℃保存。实验时取出 必要量以同样７５

ｍｍｏｌ?

Ｌ。１磷酸钾缓冲液稀释至反应体 系中的终浓度为６３

ｎｍｏｌ?

Ｌ～。ＡＡＰＨ以７５