建筑大学吧XXXXX项目-温州医科大学附属第一医院

)

，

因此其检测

MRD

的敏感性低。

RQ-PCR

法灵敏度高，

可达

10

～

10

-6

< br>，反映白血病细胞总体融合基因表达状态。同时，此两种方法均需要专门的

技术人 员或特定的仪器才能操作，

极其耗时。

融合基因通过转录翻译出融合蛋白发挥生物 学

活性，蛋白才是其发挥生物学活性的物质基础，检测融合基因或蛋白均可监控

MRD

。由于

G

显带

FISH

法和

RQ-PCR

法检测融合基因表达均有一定的缺陷，因而临床还需 要一种特异

性和敏感性俱佳的方法来检测融合基因或蛋白表达来监控

MR D

。

流式细胞仪自上个世纪八十年代进入中国以来，< /p>

目前在三乙医院以上单位均已配备，

主

要应用于检测细胞膜 和细胞内蛋白表达，是检验医学技术的重点发展方向，其中，流式分子

表型分析和流式免 疫磁珠法是其发展趋势。

流式分子表型分析是指流式分子表型分析与免疫

表型分析技术相结合，

通过

PCR

或

RT-PCR

进行引物特异的核酸序列扩增，

应用对特定基因的

特异性 寡核苷酸荧光素标记探针进行荧光原位杂交（

FISH

）

，加入针 对细胞亚群荧光素标记

的单抗，可用流式细胞仪检测分析。另一种流式免疫磁珠法即

CBA

，其原理是将包被某种抗

原或抗体的不同大小的微球与 待测液体中的相应成分反应形成抗原与抗体的复合物，

再加入

荧光素标记 的二抗，

微球上结合的待测抗原或抗体分子数量与其荧光强度呈线性关系，

由此< /p>

可对待测液体中与微球上包被抗原或抗体分子相对应的成分进行定性或定量分析，

其灵敏度

极高、能同时测定单个标本中的多种蛋白。

们

设

计

建

立

流

式

分

子

表

型

析

（

即

Flow- FISH

）

法

检

测

BCR-ABL

融

合

基

因

和

PML- RARa

融合基因的方法，

CBA

法检测

BCR- ABL

融合蛋白的方法，

并将这两种方法与

FISH

法和

RQ- PCR

法进行方法学比较，同时应用于临床检测，分析其应用价值。

研究工作内容

研究

Flow- FISH

法检测

BCR- ABL

融合基因和

PML- RARa

融合基因方法的可行性和方法

学评价。

研究流式免疫磁珠法检测

BCR-ABL

融合蛋白方法的 可行性和方法学评价，将其应用于

临床检测中分析在

Ph+

白血病诊断和治疗监控中的作用及意义。

研究工作过程、工作量

2009.01

—

2009.12

：

Flow- FISH

法检测

BCR- ABL

融合基因和

PML- RARa

融合基因方法

建立及临床标本检测。

2010.01

—

2010.12

：流式免疫磁珠 法检测

BCR-ABL

融合蛋白方法建立及临床标本检测。

2011.01

—

2011.06

：

数据整理、

统计分析、

补充检索文献补充实验、

发表论文、

准备结题、

成果鉴定

研究工作保证质量的措施

RQ- PCR

技术：

RQ-PCR

技术是本课题关键实验技术之一，本课题组已配备了多年从事分子生物学技术

的人 员（硕士研究生毕业）操作、可以确保实验材料来源的充足和可靠，可以保证实验的顺

利 进行。

细胞培养技术：

细胞培养技术是本课题关键实验技术之一，

本课题组已配备了多年从事细胞培养的人员

操作、可以确保实验材料来源 的充足和可靠，可以保证实验的顺利进行。

原位杂交技术：

RQ-PC R

技术是本课题关键实验技术之一，本课题组已配备了从事

FISH

的人员（硕士

研究生毕业）操作、可以确保实验材料来源的充足和可靠，可以保证实验 的顺利进行。

流式细细仪检测技术：

课题负责人系多年从事流式细胞术检测专门技术人员进行，而且本研究所流式细胞仪检

< br>测技术是卫生部论证单位，具有相应的检测技术资格。因此，我们的相关研究结果客观、可

靠。

时间及其它技术保证：

本项目组成员均具有硕士研究生学历或具有相关的研究经历，其中还有多年专门从事分

子生物学技术研究人员，从而在技术上确保本项目的顺利完成。

三、论文、专著目录

1

．

*******

、

******< /p>

、

*******

。流式免疫磁珠法检测

BCR-A BL

融合蛋白在白血病中的意

义。温州医学院学报，

20 11

，

41

（

3

）

：

242-244

，

248

。

< /p>

2

．

*******

、

** ****

、

*******. Values for flow cytometric detection of BCR-ABL fusion proteins

in patients with chronic myeloid leukemia. Anticancer Research

投稿中

.

四、工作中存在问题和建议

我们建立的

Flow- FISH

法检测

BCR- ABL

融合基因和

PML-RARa

融合基因方法结果不甚

理想，具体的技术方法还需摸索探讨。

另外，我们建立流式免疫磁珠法检测

BCR-ABL

融合 蛋白方法可靠，重复性好，简单，

快速，能用于

Ph+

白 血病诊断和疗效评价，具有良好的临床应用前景。

项目技术总结报告

一、项目研究背景及国内外同类技术进展情况

白血病细胞常见染色体易位，

可致融合基因产生，

转录翻译出融合蛋白发挥生物学 活性

致癌。融合基因筛查有助于准确、快速、可靠确定白血病类型，对其诊断、分型及微 小残留

病灶检测（

MRD

）具有极大价值。慢性粒细胞白 血病

(CML)

和急性早幼粒白血病（

APL

）

作为两个常见的白血病亚类，

分别表达

BCR- ABL

和

PML-RARa

融合基因，

临床可根据 融合基

因检测结果进行白血病诊断及疗效评价，常用检测方法是

G

显带

FISH

法和实时荧光定量

PCR

< br>法（

RQ-PCR

）

[1-3]

< br>。白血病治疗完全缓解后体内仍存有少量的残留细胞，是造成白血病复发

的根源， 其数量与白血病复发概率正相关

[4]

，因此检测残留细胞数量 或其特异的融合基因含

量对于调整治疗方案至关重要。

G

显带

FISH

法由于敏感性低仅用于白血病诊断，

MRD

融合基

因检测目前常用

RQ-PCR

法，由于不同

RNA

样本存在不同的逆转录效率，因而其定量存在一

定 缺陷

[5]

。融合基因通过转录翻译出融合蛋白发挥生物学活性 ，检测融合基因或蛋白均可以

监控

MRD

。由于

G

显带

FISH

法和

RQ-PCR

法检测融合基因表达均有一定的缺陷，因而临床还

需要一种特异性和敏感性俱佳的 方法来检测融合基因或蛋白表达来监控

MRD

。

流式细胞术目前主要应用于检测细胞膜和细胞内蛋白表达，

是检验医学技术的重点发展< /p>

方向，其发展趋势体现在以下方面：从相对细胞计数到绝对细胞计数；从相对定量到绝对定

量分析；从单色到多色荧光分析；从细胞膜成份到细胞内成份分析；液体中可溶性成分的 流

式细胞分析；

流式分子表型分析。

流式分子表型分析是 指流式分子表型分析与免疫表型分析

技术相结合，检测特定细胞亚群的特异核酸序列，其 基本技术路线如下：待测细胞首先与特

异性细胞亚群的单克隆抗体反应，

固定并渗透细胞，

通过

PCR

或

RT-PCR

进行引物特异的核酸

序列扩增，应用对特定基因的特异性寡核苷酸荧光素标记 探针进行荧光原位杂交（

FISH

）

，

加 入针对细胞亚群单抗的荧光素标记的二抗，通过流式细胞仪检测分析

[6]

。目前该方法常用

于检测

AIDS

患者外周血

CD4

+

细胞中

HIV

特异的

DNA

或

RNA

和染色体端粒长度< /p>

[7-8]

。

液体中可

溶 性成分的流式细胞分析即

CBA

，

其原理是将包被某种抗原或抗体 的不同大小的微球与待测

液体中的相应成分反应形成抗原与抗体的复合物，

再加入荧光素标记的二抗，

微球上结合的

待测抗原或抗体分子数量与其 荧光强度呈线性关系，

由此可对待测液体中与微球上包被抗原

或抗体分子 相对应的成分进行定性或定量分析，与酶联免疫吸附试验相比，其灵敏度高、能

同时测定 单个标本中的多种蛋白。目前

CBA

主要用于检测细胞因子表达。

常规骨髓细胞形态学检查由于敏感性低，

对监控白血病复发和提高患者长 期无病生存率

意义不大。目前临床检测白血病

MRD

方法 主要有常规细胞遗传学、流式免疫标记检测、

Southern blotting

法、

RQ-PCR

、

FISH< /p>

等。常规细胞遗传学加

FISH

法虽然能在单个细胞水平上

检测有无融合基因存在，

但由于受染色体显带质量好坏的影响，

且 通常只能分析少量分裂象

(200

～

500

个

)

，因此其检测

MRD

的敏感性低

。

Southern

blotti ng

敏感度只有

1%

～

5%

，并且

只能反映白血病细胞群体的状态而缺乏个体定量分析的价值。

RQ-PC R

灵敏度高，

可达

10

-5

～

10

-6

，反映白血病细 胞总体融合基因表达状态。

参考文献：

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Landstrom

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Tefferi

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Fluorescent

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situ

hybridization

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diagnosis,

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2)

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of

the PML-RARalpha

transcript

to

stratify

the

risk

of

relapse

in

patients

with

acute

promyelocytic

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real- time

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BCR-ABL

in

chronic

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shows

lack

of

agreement

in

blood

and

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Gupta

P,

Collins

KB,

Ratner

D,

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.

Memory

CD4(+)

T

cells

are

the

earliest

detectable

human

immunodeficiency

virus

type

1

(HIV-1)-infected

cells

in

the

female

genital

mucosal

tissue

during

HIV-1

transmission in an organ culture system. J Virol, 2002,76(19):9868-9876.

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Knudson RA, Shearer BM, Ketterling RP. Automated Duet spot counting system and manual technologist

scoring using dual-fusion fluorescence in situ hybridization (D-FISH) strategy: comparison and application

to

FISH

minimal

residual

disease

testing

in

patients

with

chronic

myeloid

leukemia.

Cancer

Genet