马来西亚莫纳什大学-马来西亚莫纳什大学
名词解释：
1
、退火（
annealing
）
:
两条寡核苷酸引物在适当温度下，分别依 据碱基互补结合在模板
DNA
扩增区域两端，称为退火。
2
、表达载体
：指用于在受体细胞中表达（转录和翻译） 外源基因的载体。除了具备复制起
始位点、
筛选标志和多克隆位点
3
个基本元件外，
还需带有外源基因在真核或者原核细胞中
表达（转录和翻译）所必须的
DNA
构件，如：启动子、终止子、阻遏 蛋白结合位点、核糖
体结合位点等。
3
、多克隆位点
：
（
MCS
，
multiple cloning sites
）
载体上含
有的一个人工合成的
DNA
片
段，其上含有多个单一酶切
位点，是外源
DNA
的插入部位。
具备条件：是载体中的
一段碱基序
列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点。
4
、非融合性蛋白：
指利用
DNA
重组技术，将一段外源基因导入细菌后，自身单独表达的、
不与细菌中表达的任
何蛋白质或多肽相融的外源蛋白产物。
5
、目的基因< /p>
：指要研究或应用的基因，也就是要克隆或表达的基因或者基因的一个片段。
6
、
Genomics
:<
/p>
基因组学，是阐明整个基因组结构、结构与功能关系以及基因之间相互作用
的科学。根据研究目的不同而分为
3
个不同的亚领域：
1.
结构基因组学
（
structural
gen omics
）
整个基因组的遗传制图、物理制图及
DNA
测序。
2.
功能基因组学
(fu
nctional
genomics)
认识、分析整个基
因组所包含的基因、非基因序列及其功能。
3.
比较基因组学
(
comparative
genomics)
比较不同物种的整个
基因组，增强对各个基因组功能及发育相关性的认识。
7
、
SNP
：
sin gle nucleotide polymorphism
，单核苷酸多态性，是指基因组水平 上由单
个核苷酸的变异所引起的
DNA
序列多态性。
在人群中
SNP
的发生频率至少大于
1%
，
SNP
是人类可
遗传的变异中最常见的一种
，也是基因组中最为稳定的变异。其最大程度地代表了不同个体之间的遗传差
异，因而可
作为研究多基因疾病、药物遗传学及人类进化的重要遗传标记。
8
、假基因：
（
pseudogenes
，
ψ
）是指与某些有功能的基因结构相似，但不能表达产物的基
因。
假基因的产生是由于功能基因发生突变或
cDNA
插入所致。 由突变而引起的功能缺失通常是在编码区
引入了终止密码子，这种假基因称为重复假基因
或传统假基因。由插入了
mRNA
反转录生成的
cDNA
而造成
的假基因称为加工假基因或返座假基因。
9
、杂合子丢失（
loss of heterozyg osity
，
LOH
）
:
是指从亲代遗传而来的受精卵开始就
带有某等位基因突变的杂合子个体再次发生遗传损
伤，
导致野生型显性基因突变或缺失形成
突变纯合子，失去原有的杂合状
态。
举例：视网膜母细胞瘤发生的“二次打击理论”认为：亲代遗
传而来的一个
rb
基因或生殖细胞已经遭受一次打击（
RB
变为
rb
），此
RB/rb
杂合子再次 发生损伤可使得
原有的正常
RB
也丢失，由此引起癌变。
10
、
Oncogene
：癌基因，指细胞内控制细胞生长和分化的基因，它的结构异常或表达异
常，
可以引起细胞癌变。
广泛存在于从单核细胞到人类在内的基因组中，
在进化上高度保守，
表达产物对细胞的正常生长、
增殖与分化 发挥着精密的调控作用，
异常活化往往促进细胞恶
性转化，
诱导肿瘤发生。
包括所有编码生长因子、
生长因子受体以及与生长相关的信号分 子
和转录因子的基因。
11
、基因诊断
（
gene d iagnosis
）
：
是利用现代分子生物学技术从
DNA/RNA
的水平进
行检测，分析体内致病基因的存在、
变异和表达状态，从而对疾病作出诊断的过程。
12
、 基因治疗
(
：
是通过将外源性正常基因导入病变细胞中、或将特定 的基因导入非病变细
胞、
或向功能或生物学特性异常的细胞中导入细胞本 不表达的基因等，
使导入基因表达产物
在体内发挥作用，
或采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因，
从而达到治疗疾病目的的
一种方法。
13
、
生物信息学
：
是一门新的前沿交叉学科，
采用数理和信息科学理论、
技 术和方法研究生
命现象，理解和组织与生物分子相关的信息。
目
前的研究重点和关键突破主要是在基因组学和蛋白
质组学两方面，是人们能够从核酸和蛋
白质的序列数据开始，经一系列分析手段归纳和预测其中所蕴藏的
关于结构与功能的信息
。
14
、表观遗传学
：是指在
DNA
序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，
并产生可遗传的表型。其特征可概括为
DNA
序列不变，可遗传，具有 可逆性。在分子角度
也可定义为
“在同一基因组上建立并将不同基因表达
（转录）
模式和基因沉默传递下去的染
色质模板变化的总
和”。
15
、
染色质重塑
：
染色质和单个核小体内发生的任何可检测到的变化。
重塑的染色体表现为
对核酸酶高度的敏感以及组蛋白结构和位置改变等特点。
目前已知有两类复合 体调节染色质
重塑：
ATP
依赖的染色质重塑复合体和染 色质共价修饰复合体。
16
、
CpG
island
：
CpG
岛，
< p>CpG指“
CG
”核苷酸对，其中
G
在
DNA
链中紧随
C
后。在脊
椎动物中，
CpG
二核苷酸是最重要的甲基化位点，
它 在人类基因组中呈不均匀分布。
但在一
些区域
CpG
常成簇存在，
人们将这段富含
CpG
的
DNA
称为
CpG
岛，
通常长度在
1-2kb
左右。
CpG
岛常位于转录调控区附近，在基 因组中，约有
60%
以上基因的启动子含有
CpG
岛，它
的甲基化与基因的转录调控密切相关。
17
、
RNAi
：
RNA
interference,
RNA
干扰，
是指在进化 过程中高度保守的、
由双链
RNA
（
ds RNA
）诱发的、有特定酶参与的同源
mRNA
高效特异性降解（ 特异性基因沉默）的现象。
它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。<
/p>
18
、反式作用因子
（
trans- acting
factor
）：又称转录因子（
TF
< p>），指存在于真核细胞内、能
识别并结合特定的
DNA
序列，
使基因开放或关闭的一组序列特异性的
DNA
结合蛋白。
TF
一
般具有三个功能结构域
: DNA
识别结合域，转录激活域，蛋白质
-
蛋白质结合域；能特异性识< /p>
别和结合顺式作用元件；
结合后通过促进或抑制转录起始复合物形成过程中 的各步反应，
以
激活或阻遏下游基因的表达。
问答题
：
1.
试述
PCR
技术的基本原理、过程和引物设计原理。
（
1
）基本工作原理：在体外模拟体
内的
DNA
复制的过程，以拟扩增的
DNA
分子为模板；用
2
个寡核苷酸片段作为引物，
分别在拟扩增片段的
DNA
两侧与模板
DNA
链互补结合，提供
3
‘
—
OH
末端；在
DNA
聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的
DNA
合成，不
断重复这一过程，即可使目的
DNA
片段 得到扩增。
PCR
反应的特异性依赖于与靶序列
两端互补
的寡核苷酸引物。
(2)
过程：在反应管中加入反应缓 冲液、
dNTP
、
DNA
模板和
D NA
聚合酶，混匀后加石蜡油封
盖液面防止反应液的挥发。然后将反应管
置于
PCR
仪中开始以下循环反应。
1
、变性：加热使双链
DNA
模板解旋成单链（
T
：
95
℃左右）。模版
DNA
在
95
℃左
右的高温条件下双螺旋的氢键断裂，双链
DNA
解链成为单链
DNA
并游离于反应液中；（解
链）
2
、退火：降温使引物与
DN A
模板互补区域结合形成杂交链（
T
：
55
℃左右）。两
个寡核苷酸引物在适当温度下，分别依据碱基互补结合在模版
DNA
扩增区域两端，
DNA
聚
合酶开始合成新链；（引物与模版连杂交，新链开始合成）
3
、延伸：温度升至
72
℃左右，
Taq
DNA
聚合酶催化以引物为起始点的
5'
→
3'
DNA
链延伸反应，形成新生
DNA
链。 在
4
种
dNTP
底物及
Mg2+< /p>
存在下，
DNA
聚合酶在最适作用
温度下将
单核苷酸按碱基互补配对原则从引物的
3`-
端掺入，使引物沿着
5`
→
3`
方向延伸合
成新股
。每一循环的产物再继续作为下一循环的模版。（合成新链）
每一循环的产物再继续作为下一循环的模板。循环次数：
25
～
35
，不超过
40
次
(3)
引物设计总原则：提高扩增的效率和特异性。
< /p>
一般原则：
1
、长度：
16
～
40
个核苷酸，以
18-24
个为最佳。
2
、引物末端：
< p>3′端的碱基最好选
T
、
G
、
C
而不选
A
。
3
、引物内、引物间不应有互补序列
4
、引物应位于基因组
DNA
的 保护区，且与非特异扩增区无同源性
5
、引物的
GC
含量和
Tm
< p>值:G+C
碱基含量应保持在
40%-75%
之间，以维持
Tm
在
56-62
℃范围内 。
6
、
3
′端必须与模板
DNA
互补配对，
3
′端的碱基最好选
T
、
G
、
C
而不选
A
。
7
、
5
′端可游离，添加修饰位 点。
（
3
）引物设计原理：引物设计的 总原则就是提高扩增的效率和特异性。
①引物的位置：用于基因组
DNA
的引物序列应位于基因组
DNA
的保守区，且与 非扩增区
无同源序列。若以
cDNA
为模版，则首先应尽 力使引物和产物保持在
mRNA
的编码区内，其
次尽量将
引物放到不同的外显子上，以便使特异的
PCR
产物与从污染
DN A
中产生的产物在
大小上相区别；
②引物的长度：每一条引物长度（与模版
DNA
序列互补的部分）以
18~24mer
为最佳；
③引物末端：
3`-
端碱基最好选
T
、
G
、
C
而不选
A
，
5`-
端碱基无严格限制。一对引物之间
不应存在互补序列，每一个引物内部也应避免形
成二级结构；
④引物的
GC
含量和
Tm
值：
G+C
碱基含量应保持在
40 %~75%
之间，
以维持
Tm
在
5 6~62
℃
范围内。
2.
制备目的基因常用的方法有哪几种？简述重组
DNA
的基本过程。
制备目的基因常用的
方法
有：酶切法直接获得目的
DNA
片段；体外扩增合成目的
DNA< /p>
片段；筛选文库获得
目的
DNA
片段；化学 合成－
PCR
搭接法获得目的
DNA
片段。也可用 计算机克隆法：首
选对拟克隆的
DNA
序列在种属间进行 同源性或相似性比较，
找出目的
DNA
的保守序列
并作为引物合成靶序列以减少盲目性。
重组
D NA
基本过程包括：①欲进行重组的
DNA
片段（目的基因）的获 取；②载体的选择
及准备；
③目的
DNA
片段与载体的连接；
④重组
DNA
导入宿主细胞；
⑤含重组
DNA
宿主细
胞的克隆化及鉴定。五大环节。<
/p>
一、
(1)
构 建基因组
DNA
文库后从中筛选目的基因
（
2)
构建
cDNA
文库后从中筛选目的基因< /p>
(3
）设计一对目的基因引物，用
< p>PCR或
RT- PCR
技术体外扩增目的基因片段
(4< /p>
）化学合成已知序列的长度不是太大的
DNA
片段
（
5)
直接用限制酶从基因组
DNA
、或
cDNA
片段，或含目的基因的重组体上切取。重组
DNA
技术的基本过程：
①制备目的基因和相关载体。
②将目的基因和有关载体进行连接③将重组
的
DNA
导入 受体细胞④
DNA
重组体的筛选和鉴定⑤
DNA
重组体的扩增、表达和其它研究
（或）
1
、载体的选择和制备
——
分；
< p>2、制备目的基因片段
——
切
3
、
DNA
片段的重组连接
——
接；
4
、重组
DNA
导入受体细胞
——
导
5
、转化子的筛选
——
筛；
6
、重组子的筛选
——
筛；
7
、重组子的鉴定
——
鉴
8
、克隆扩增或表达
——
扩
/
表；
9
、基因工程的后处理
——
分
3
、简述表达载体和克隆载体在结构上的异同。
（
1
）
克隆用质粒载体的结构简单，
< p>其主要功能是可携带目的DNA
在宿主细胞中复制扩增，
从而经过克隆筛选获得克隆筛选获得重组
DNA
。
pBR32 2
和
pUC18
/19
是经典代表，
目前用的
多是改进而来的。结构上含有复制起始点，筛选标记，多个单一酶切位点（获
多克隆位点
MCS
）。
（
2
）表达用质粒载体是在克隆载体的基础上，加上用于插入基因能够在宿主细胞（原核
细胞或真核细胞）内表达所需的必要元件，如启动子、终止子、核糖识别位点等。
①原核表达的质粒载体：除具备一般克隆载体所具有的必要元件外，还需要在
MCS
的上
下游分别提供启动子和终止子，从而使其与插
入基因共同组成完整的转录单位。
②真核表达质粒载体：
一般由两部分组成，
一部分用于在原核细胞中复制及筛选，
一部分
用于在真核细胞中复制、筛选及表达。
< br>（一）克隆载体的结构：
（
a
）必须是一个复制子，能在受 体细胞中复制：
1
、复制起点
Ori
。
2
、复制区。
3
、复制终点
term
。（
b
）带有抗药性基因：
Tet r
：编码膜蛋白，阻止
Tet
进入
细胞；
Amp r
：
β
-
内酰胺环水解酶；
Kan r
：
Kan
～
P
, neo
～
p
；
Cam r
：氯霉素乙酰基转
移酶（
C
）具有多克隆位点（
d
）可导入 受体细胞
（二）表达载体的结构：表达载体
=
克隆载体
+
表达元件
原核表达载体：“启动子
—
核糖体结合位点
—
< p>克隆位点—
转录终止信号”；
真核表达载体的基本转录元件：
原核序列（克隆用）
+
真核序列（表达用）
复制子真核抗药基因
+
真核表达元件
抗药基因（或真核复制起始点）
真核表达元件
：“启动子
/
增强子
—
克隆位点
—
转录终止信号
—
poly(A)
加尾信号”
另一版答案：克隆载体
是用来在受体细胞中克隆和扩增
DNA
片段的载体。
1
、
可导入受体细< /p>
胞
2
、能够在受体细胞中复制
3
< p>、具有克隆位点4
、带有药物抗性基因，便于筛选
表达载体
是用来在受体细胞中转录和翻译外源基因的载体。
原核表 达载体的表达构件表
达载体
=
克隆载体
+
表达元件。
“
启动子
—
核糖体结合位点
—
克隆位点
—
转录终止信号
真核表达载体的基本成分：①启动子和增强子②转录终止和加尾信号
4
、试述怎样进行疾病基因的定位和克隆。
< p>
疾病基因的定位：可选用连锁分析、候选基因关联分析、全基因组关联分析等研究方案。< p>
研究单基因遗传病的基因一般应用连锁分析；
针对已知候选基因可进行关联分析；< /p>
在无假说
条件下可使用全基因组关联分析进行研究。
疾病基因的克隆包括定位克隆和功能克隆两策略。定位克隆①确定基因在染色体上的位
置；
②获得基因所在区段的克隆重叠群；
③确定候选基因的染色 体片段；
④从这些片段中筛
选出目的基因，并作突变检测验证和功能分析
。功能克隆：是从蛋白质到
DNA
的研究路线，
尤其是出
生缺陷引起的分子病。
先获得纯化的蛋白，
再①：
根据已知部分氨 基酸序列合成寡
核苷酸作为探针，筛选
cDNA
文库；或 ②：利用特异性抗体筛选表达型
cDNA
文库。在获得
阳
性克隆后，
经学列测定和动能分析确定其是否为致病基因。
也可通过比较正常和疾 病情况
下
mRNA
表达差异来克隆疾病相关基因。
定位：
连锁
4
分析和关联分析是定位疾病相关基因的重要手段，
1
、研究单基因遗传疾病一般
应用连锁分析，
即是利用与致病基因 相连的某些基因座作为遗传标志，
通过鉴定遗传标志的
存在而判断个体是
否带有致病基因。
2
、针对已知候选基因可进行关联分析即是观察候选基
因异常与疾病性状在人群中的统计学关系。
3
、在无假说条件下可 使用全基因组关联分析进
行研究。
即是通过扫描整个基因组观察哪些基因 与疾病表型间存在关联，
将这些不同的遗传
变异与某些性状联系起来。<
/p>
克隆：
疾病基因的克隆包括定位克隆和功能克隆两种，
定位克隆：
a
、
通过家系连锁分析资料或染色体异常等数据确定 基因在染色体上的位置。
b
、通过染色体歩移、染色体区带显微切割等技 术获得基因所在区段的克隆重叠群。
C
、确
定含有候选基
因的染色体片段。
D
、从这些片段中进一步筛选目的基因并作突变检测验证和
功能分析
功能克隆：指从致病基因的功能出发克隆
该致病基因。有以下两种方式“
a
、根据已知
的部分的氨
基酸序列合成寡核苷酸作为探针，筛选
cDNA
文库，
b
、利用特异性抗体筛选表
达型
cDNA
文库。
5
、试举例说明癌基因诱导肿瘤发生的基本原理。
癌基因广泛存在于从单核细胞到人类在内的基因组中，
在进化上高度保守，< /p>
表达产物对细
胞的正常生长、增殖与分化发挥着精密的调控作用。
许多癌基因是对细胞的生长增殖发挥正性调控作用的功能基因，
当这些基因发生结构性异
常活化时，
必然导致细胞生长增殖与分化异常， 部分细胞甚至发生恶性改变形成肿瘤。
【活
化癌基因可诱导肿瘤发生的几
个典型机制：染色体异位突变、基因点突变、基因扩增、
DNA
重排、病
毒基因组
LTR
（长末端重复序列）整合、癌基因的低甲基化修饰改变。】
1
、染色体易位突变
活化癌基因诱导肿瘤发生
。
如：
< /p>
2
、基因点突变
活化癌基因诱导肿瘤发生
。
如
3
、
3
、基因扩增
活化癌基因。。。。
如
4
、
DNA
重排。。。。。。。
另一版本答案：
5
、病毒基因组
LTR
序列整合活化。。。。。。。。。
如